Síndrome de Wiskott-AldrichModelos celulares humanos para estudios preclínicos de vectores lentivirales para terapia génica

Abstract

El síndrome de Wiskott-Aldrich es una inmunodeficiencia primaria ligada al cromosoma X causada por mutaciones en el gen WAS, afectando a todo el linaje hematopoyético. La expresión de WAS está regulada por dos promotores; promotor proximal, de 1.6Kb, situado justo en el sitio de inicio de la trasncripción y el promotor proximal o distal, de 0.6Kb, situado a 6Kb aguas arriba del promotor proximal.El gen WAS, de expresión específica de linaje hematopoyética, codifica una proteína multimodular citoplasmática (WASP) cuya función más estudiada es relativa a la integración de señales extracelulares, mediando así la nucleación de la actina y reorganización del citoesqueleto celular. Sin embargo el rol de WASP en el linaje megacariocítico resulta controvertido, aunque diversas evidencias indican una función más especializada de WASP en plaquetas. Actualmente, el único tratamiento curativo es el trasplante de médula ósea, que no siempre es posible debido a la falta de donantes compatibles. Por ello, la terapia génica emerge como una alternativa real al trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos. En la actualidad, se están llevando a cabo diferentes ensayos clínicos utilizando el vector lentiviral WW1.6, que regula la expresión de WASP bajo el promotor proximal endógeno de WASP. A pesar de que la gran mayoría de los pacientes manifiestan una mejoría significativa en los síntomas, persiste la microtrombocitopenia característica de esta enfermedad y en algunos casos lossangrados y hemorragias. Resolver esta cuestión promueve la búsqueda de nuevos vectores que consigan restaurar el fenotipo sano en las plaquetas deficientes de los pacientes con WAS. Estos vectores persiguen no sólo ser seguros, sino que sean capaces de mimetizar el patrón de expresión de WASP endógeno durante la megacariopoyesis y trombopoyesis. Dado que el papel de WASP durante el desarrollo megacariocítico permanece en debate abierto, con resultados controvertidos, la necesidad de esclarecerlos es clave para la mejora de vectores lentiviralesterapúeticos. La dificultad para la obtención de muestras de progenitores hematopoyéticos de pacientes con WAS nos llevó al desarrollo de un modelo celular en células madre embrionarias humanas, que permitiera estudiar los defectos asociados a la falta de WASP. Con éste, hemos descrito que la ausencia de WASP produce un adelantamiento de la diferenciación hematopoyética temprana y megacariocítica. Proponemos, por lo tanto, que WASP juega un papel de regulador negativo durante la diferenciación megacariocítica. El objetivo principal de la tesis es desarrollar nuevos vectores lentivirales para mejorar la terapia génica de WASP. Para ello estudiamos la cinética de expresión fisiológica de WASP durante el proceso de diferenciación megacariocítica en progenitoresmegacariocíticos, megacariocitos y plaquetas derivados de HSCs. Hemos llevado a cabo estudios preliminares en líneas celulares humanas inmortalizadas, MEG-01 y K562_WASKO. El estudio en conjunto, con los modelos celulares y las HSCs nos ha permitido comprobar si diferentes vectores lentivirales, vectores lentvirales reporteros y LVs-WAS, los cuales combinan distintos elementos de los promotores proximal y alternativo de WAS, mimetizan el patrón endógeno de WASP durante la diferenciación megacariocítica. Así pues, hemos observado una mimesis parcial de la cinética de expresión del transgén respecto a la proteína endógena durante la formación de megacariocitos y plaquetas. También mostramos resultados del rescate terapéutico de células madre procedentes de médula ósea de un paciente con el síndrome deWiskott-Aldrich, analizando la expresión diferencial de WASP de dos vectores terapéuticos diferentes: el actual vector utilizado en clínica, WW1.6 y el nuevo vector lentiviral que proponemos, AW, que incorpora parte del promotor alternativo endógeno de WAS. Los resultados obtenidos indican que el nuevo vector lentiviral desarrollado, AW, mejora el perfil de expresión de WASP, durante la diferenciación megacariocítica, tanto en estadios tempranos de la diferenciación como en PLTs.