Influencia del consumo de leche fermentada de cabra sobre patrones de expresión génica y proteica relacionados con el metabolismo del hierro y estrés oxidativo durante la recuperación de la anemia ferropénica nutricional

Resumen

INTRODUCCIÓN El hierro es un componente biológico esencial para los organismos vivos en los que participa en un conjunto de reacciones bioquímicas de gran importancia, rutas bioenergéticas, aporte de oxígeno a los tejidos y síntesis de ADN, entre otras. Casi todas las células del organismo requieren hierro como cofactor crucial en múltiples procesos bioquímicos del organismo tales como detección y transporte de oxígeno, transferencia de electrones y catálisis. Es por tanto un elemento indispensable para la vida. Sus requerimientos varían en función de los cambios y necesidades fisiológicas que sufre el organismo durante su desarrollo, existiendo diferencias según el grupo poblacional. Como promedio un adulto almacena aproximadamente 1-3g de hierro, gracias al equilibrio entre la absorción y las pérdidas. Alrededor de 1mg de hierro se pierde al día por desprendimiento de células epiteliales y superficiales de mucosas, incluidas las del tracto gastrointestinal. Además la menstruación contribuye a la pérdida de hierro, incrementando ésta en 2mg al día en mujeres adultas pre-menopáusicas. El hierro se absorbe por los enterocitos maduros en las vellosidades superiores del intestino delgado. Aunque se ha observado que algunas partes más distales del tracto gastrointestinal pueden absorber pequeñas cantidades de hierro, son las partes proximales del intestino delgado (duodeno y primera porción del yeyuno), las que están especialmente adaptadas para su absorción. El hierro debe atravesar tanto la membrana apical del borde de cepillo como la membrana basolateral de los enterocitos para pasar de la luz intestinal al torrente sanguíneo. Una vez absorbido, el hierro es transportado, metabolizado o almacenado, siendo uno de los principales órganos de depósito el hígado. La deficiencia de hierro implica el agotamiento de los niveles de hierro total del organismo, especialmente el de depósito presente en los hepatocitos y macrófagos. Teniendo en cuenta que la mayor cantidad de hierro se utiliza para la síntesis de la hemoglobina implicada en la producción de millones de eritrocitos al día, la anemia es el signo más evidente de deficiencia de hierro, y la anemia por deficiencia de hierro a menudo se considera sinónimo de deficiencia de hierro. De hecho, según la Organización Mundial de la Salud (OMS), la anemia por deficiencia de hierro constituye el segundo problema de salud pública a nivel mundial. A pesar de ello, el hierro también tiene la capacidad de generar radicales oxidativos nocivos para la salud. Su regulación en nuestro organismo depende de los procesos de absorción, metabolismo y excreción, pero en algunas situaciones no fisiológicas o enfermedades, el hierro puede acumularse en exceso. Este exceso de hierro podrá provocar un daño oxidativo y disfunción orgánica en diferentes órganos o tejidos, pudiendo conducir a una lesión celular citotóxica (daño en el ADN, peroxidación lipídica, modificación de proteínas y daño mitocondrial). Así pues, el estrés oxidativo se define como el desequilibrio que existe entre la formación y/o acumulación de radicales libres y la capacidad de los sistemas de defensa del organismo para eliminarlos o contrarrestar su acción. Se ha caracterizado como una alteración en el equilibrio prooxidante a antioxidante a favor de las especies oxidantes, lo que lleva a un daño potencial. Así pues, se ha asociado a una cantidad de especias reactivas de oxígeno (EROs) como resultado de un desequilibrio entre la generación y la eliminación de las EROs. Por lo tanto, el estrés oxidativo conlleva una mayor producción de radicales libres, pero también afecta a los mecanismos de defensa antioxidante del organismo, que se ven diezmados. El daño inducido en el estrés oxidativo por los radicales libres contribuye a la fisiopatología y patogénesis de muchas afecciones de salud como las enfermedades cardiovasculares, cáncer, afecciones neurodegenerativas (Alzheimer, Parkinson, enfisema, entre otras). Por lo tanto, el potencial daño oxidativo generado por la participación del hierro en las reacciones redox, podría deberse a transporte o almacenamiento de hierro inadecuados durante la anemia ferropénica nutricional, pudiendo dar lugar a su acumulación en el organismo. La leche fermentada se ha reconocido como un alimento funcional, lo que sugiere que su uso tiene un efecto directo y medible en la promoción de la salud. Existen algunos estudios sobre los efectos beneficiosos de la leche fermentada en el sistema inmunitario, quelación de iones metálicos, inhibición enzimática e inhibición de la autooxidación de ascorbato. Sin embargo, es necesario un análisis exhaustivo de la influencia de la leche fermentada en la homeostasis del hierro, el estrés oxidativo a las principales biomoléculas y los mecanismos de defensa enzimática antioxidante. Por otra parte, la leche de cabra contiene compuestos beneficiosos para la salud como son los péptidos bioactivos, ácido linoleico conjugado y oligosacáridos y se ha observado que mantiene unos niveles adecuados de triglicéridos y disminuye los niveles plasmáticos de colesterol. Contiene ácidos grasos esenciales como el linolénico, araquidónico y linoleico, así como ácidos grasos de cadena corta y media (cáprico, caprílico y caproico). También contiene proteínas de alto valor biológico y fácil absorción. Respecto a su perfil mineral contiene selenio, cinc y cobre, minerales antioxidantes, a los que mejora su utilización nutritiva, pudiendo ejercer un efecto positivo en procesos oxidativos. Entre sus minerales destacan el calcio y el fósforo, que presentan una elevada digestibilidad, y una mejor absorción, y además mejora el uso del hierro minimizando las posibles interacciones con otros minerales (calcio, fósforo, y magnesio). Atendiendo a su contenido vitamínico, la leche de cabra es fuente de vitaminas A, E, D, riboflavina, niacina y tiamina. Así pues es un alimento muy saludable que influye positivamente en el metabolismo del hierro, además, la leche de cabra presenta una gran similitud con la leche materna, sus valores nutritivos son aproximados y se considera una alternativa muy válida como sustituta de la humana. OBJETIVOS Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo general de esta Tesis Doctoral es conocer los efectos de una dieta basada en un fermentado lácteo de cabra con contenido normal o sobrecarga de hierro, durante la recuperación de la anemia ferropénica nutricional, sobre la homeostasis del hierro a nivel duodenal y hepático como órganos clave del metabolismo de este mineral y evaluar el daño oxidativo a las principales biomoléculas del organismo y el estado de las defensas enzimáticas antioxidantes, durante la repleción crónica con hierro teniendo en cuenta el potencial pro-oxidante de este mineral. MATERIAL Y MÉTODOS Para lograr la consecución del objetivo general de esta Tesis Doctoral, se ha llevado a cabo el siguiente diseño experimental: • Período pre-experimental (PPE): Las ratas (n=100), recién destetadas, se dividieron aleatoriamente en dos grupos experimentales (control y anémico), con el fin de inducir la ferrodeficiencia. Para ello durante 40 días, el grupo anémico recibió una dieta estándar AIN-93G con bajo contenido en hierro (5.91 ± 0.36 mg/Kg por análisis), siguiendo la técnica previamente desarrollada por nuestro grupo de investigación (Pallarés et al., 1993). Para la elaboración de esta dieta se omitió el hierro del suplemento mineral. El grupo control recibió la dieta AIN-93G con contenido normal de hierro (44.72 ± 0.98 mg/Kg por análisis) (Reeves et al., 1993). • Período experimental (PE): Al finalizar el PPE, los animales de experimentación, (controles y anémicos) se dividieron en 8 subgrupos (n=10) y fueron alimentados durante 30 días con dietas basadas en fermentados lácteos de cabra (raza Murciano-Granadina) o vaca (raza Holstein), con contenido normal de hierro (45 mg/kg dieta) o con sobrecarga (450 mg/kg dieta) (Raja et al., 1994) para proceder a la recuperación de la anemia ferropénica nutricional inducida. Tras la finalización de ambos períodos experimentales, 10 ratas del grupo de control y 10 ratas del grupo anémico en el PPE, así como las 80 ratas en el PE, se desangraron por completo mediante canulación de la arteria aorta abdominal para determinar el estado antioxidante total del plasma (TAS), contenido de hierro, capacidad total de unión al hierro (TIBC), saturación de transferrina, ferritina, hepcidina y transaminasas séricas. Después del sacrificio de los animales experimentales, los órganos se extrajeron, procesaron y preservaron lo más rápido posible, para inducir las menores alteraciones posibles. Al final del PPE se extrajo el hígado de los animales sacrificados. Al final del PE, se extrajeron el cerebro, el hígado y el duodeno para la determinación de proteínas y genes de las proteínas relacionadas con la homeostasis del hierro. El mismo día del sacrificio, se obtuvieron las fracciones citosólicas y membranas de eritrocitos, cerebro, hígado y mucosa duodenal para el análisis posterior de enzimas antioxidantes, hidroperóxidos, proteínas carbonilo, 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina y electroforesis en gel de células aisladas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tras la inducción de anemia con privación de hierro durante 40 días, todos los parámetros hematológicos en el grupo anémico fueron menores con respecto al grupo control, excepto ADE, recuento de plaquetas y TIBC que fueron mayores. El recuento de glóbulos blancos permaneció sin cambios después de la inducción de anemia. Una vez finalizó la administración de las dietas basadas en leches fermentadas de cabra o vaca, a nivel duodenal se observó que la leche fermentada de cabra incrementó la expresión génica de Dcytb, DMT1, FPN1 y Ftl1 en los enterocitos y disminuyó la de TfR1 y Hamp tanto en animales controles como anémicos. Además la anemia disminuyó la expresión génica de Dcytb, DMT1 y Ftl1 en los animales alimentados con leche fermentada de vaca sobreexpresando TfR1 y Hamp. Finalmente se observó que la sobrecarga de hierro dio lugar a una menor expresión de Dcytb y TfR1 en animales alimentados con leche fermentada de vaca y, mientras que la expresión de DMT1 y FPN1 fue mayor. También se evaluó el efecto de la administración de alimentos fermentados de leche de cabra y vaca a nivel hepático. En general el consumo de leche fermentada de cabra, tanto con contenido normal como con sobrecarga de hierro, aumentó la expresión génica de DMT1, FPN1 y FTL1 y la expresión proteica de DMT1 y FPN1. Sin embargo, la expresión génica de HAMP fue menor en todos los grupos de animales alimentados con leche fermentada de cabra, y la expresión de la hepcidina disminuyó en animales controles y anémicos alimentados con leche fermentada de cabra con contenido normal de hierro. Asimismo se evaluó el daño oxidativo a las principales biomoléculas y los mecanismos de defensa enzimática antioxidante observándose un aumento significativo de enzimas antioxidantes endógenas (SOD, CAT, GPx y GR), junto con un aumento plasmático en el TAS y una disminución en plasma y orina de 8-OHdG en animales que consumieron una dieta basada en leche fermentada de cabra. Por el contrario, las roturas en la doble cadena de ADN, los hidroperóxidos (en plasma, eritrocitos e hígado), los 15-F2t-isoprostanos urinarios y los grupos carbonilo de proteínas (en plasma y mucosa duodenal), fueron más bajos en los animales alimentados con leche fermentada de cabra, revelando una mejora en la actividad antioxidante sistémica y celular del plasma y los tejidos. Por todo ello, los resultados obtenidos aportan un mejor conocimiento de los mecanismos de absorción de hierro a nivel duodenal y de la ventaja que la leche fermentada de cabra induce en ese proceso durante la recuperación de la anemia ferropénica nutricional. Además, se pone de manifiesto que la leche fermentada de cabra ejerce un efecto beneficioso en la regulación de genes que codifican la síntesis de proteínas involucradas en el metabolismo del hierro, desempeñando un papel clave en el aumento de la repleción de hierro durante la recuperación de la anemia, induciendo una adaptación fisiológica de los genes y proteínas del hígado, de manera coordinada con la fluctuación de los niveles de hierro celular, favoreciendo la homeostasis del hierro corporal. En relación con los procesos de daño oxidativo y defensa antioxidante, el consumo de leche fermentada de cabra demuestra un aumento en los niveles de TAS, como efecto protector, junto con menores niveles de biomarcadores de daño oxidativo, revelando que la leche fermentada de cabra puede proteger a los principales componentes biológicos celulares (lípidos, proteínas, ADN) del daño oxidativo provocado durante la recuperación de la anemia. CONCLUSIONES 1. Las dietas basadas en leche fermentada de cabra aumentan la expresión génica y proteica de Dcytb, a nivel intestinal y DMT1 y FPN1 en duodeno e hígado, proteínas clave implicadas en la homeostasis del hierro, indicando no sólo una mejor recuperación hematológica, sino también una mayor movilización de hierro desde su almacenamiento hepático hasta los órganos diana, provocando un efecto hepatoprotector durante la sobrecarga de hierro. 2. La baja regulación de la hepcidina a nivel duodenal, tras el consumo de las dietas basadas en leche fermentada de cabra, aumentó el flujo de hierro desde las células duodenales a los tejidos, favoreciendo la hematopoyesis lo que lleva a una mejor absorción de hierro y recuperación de la anemia. Además la menor expresión de la hepcidina hepática aumenta el flujo de salida de hierro de los hepatocitos a la circulación general, dada la correlación inversa entre la expresión de hepcidina y FPN1. 3. Las dietas basadas en leche fermentada de cabra aumentan la expresión génica de FTL1 a nivel duodenal y hepático, asegurando un mayor secuestro intestinal de hierro y mejorando su almacenamiento hepático, hecho que se explica por el aumento de expresión de las proteínas DMT1 y FPN1. Además, la sobrecarga de hierro aumenta la expresión génica de FTL1, como un mecanismo compensatorio para evitar el daño oxidativo a las principales biomoléculas, debido al carácter pro-oxidante de este mineral. 4. La deficiencia de hierro conduce a una mayor producción de hidroperóxidos en eritrocitos, hígado y mucosa duodenal, como consecuencia de las alteraciones estructurales de la membrana celular. Sin embargo, este daño oxidativo es específico de los lípidos, ya que no se ha registrado un aumento de estrés oxidativo en las proteínas, prostaglandinas o ADN, debido a la deficiencia de hierro. 5. El consumo de dieta basada en leche fermentada de cabra induce un efecto protector en plasma, eritrocitos, hígado y cerebro, disminuyendo los niveles de hidroperóxidos, grupos carbonilo e isoprostanos y aumentando el estado antioxidante total, lo que se correlaciona directamente con la mayor expresión génica y actividad hepática de las enzimas antioxidantes SOD, CAT, GPx, GR, revelando un menor estrés oxidativo inducido durante la recuperación de la anemia ferropénica nutricional. 6. La dieta basada en leche fermentada de cabra tiene un papel positivo en la estabilidad genómica, reduciendo la fragmentación de la doble hélice de ADN y los niveles de 8-OHdG, debido a la alta biodisponibilidad de magnesio y zinc, que mejora la estabilidad genómica y promueve la reparación del material genético. Conclusión General La dieta basada en leche fermentada de cabra, en comparación con la de vaca, resulta ser más beneficiosa en la recuperación de los efectos nocivos causados por la deficiencia de hierro, ya que induce una adaptación fisiológica intestinal y hepática de los genes y proteínas clave relacionados con la homeostasis del hierro. Además, el consumo de esta dieta induce un efecto protector en las principales biomoléculas, al disminuir los biomarcadores de daño oxidativo y aumentar el estado antioxidante total, que se correlacionan directamente con la expresión y actividad de las enzimas antioxidantes, durante la recuperación de la anemia.