Topología básica de la HMGCOA reductasa mediante análisis computerizado de sus secuencias y estudio de la holoenzima reconstituida en vesiculas fosfolipidicas

Abstract

Se ha abordado la topologia basica de la hmgcoa reductasa mediante la aplicacion de metodos predictivos de estructura de proteinas a partir de la secuencia, implementando algunos descritos en la bibliografia y tambien los procedimientos nuevos diseñados en este trabajo. Entre ellos se ha optimizado un metodo original para el analisis predictivo de segmentos transmembrana, que aplicado a la hmgcoa reductasa conduce a un modelo politopico constituido por 8 segmentos transmembrana, opuesto al modelo de 7 segmentos previamente descrito para esta enzima. Como resultado de este analisis se ha obtenido un modelo de estructura secundaria para la enzima, en el que se han identificado 2 sitios potenciales de union a nucleotidos muy conservados (probablemente son los sitios de union de hmgcoa y nadph). Aunque con menor fiabilidad, algunos de los datos obtenidos son compatibles con la existencia de un sitio de union a acidos grasos y un tercer sitio de union a nucleotido. Para probar estos dos puntos se ha desarrollado un procedimiento de reconstitucion in vitro de la holoenzima en vesiculas fosfolipidicas. En este sistema el colesterol y los lipidos microsomales ejercen un efecto inhibidor sobre la reductasa reconstituida, y apoyan la hipotesis de una interaccion directa del dominio de membrana con algun componente de su entorno lipidico. El estudio de la influencia de diferentes nucleotidos sobre la actividad de la enzima reconstituida ha puesto de manifiesto un potente efecto inhibidor dependiente de adp y ca2+, independiente de la modulacion covalente de la enzima mediante fosforilacion-defosforilacion, que puede prevenirse por adicion de alln, un inhibidor especifico de calpainas. En base a la homologia local de la hmgcoa reductasa con otras proteinas de union a nucleotidos de estructura conocida, se han asignado coordenadas atomicas relativas al dominio de union a nadph de esta enzima. El modelado de esta region ha incluido la mini