Relación entre las proteínas parp-1 y hif1a durante la respuesta a hipoxia tumoral

  1. Marti Martin-Consuegra, Juan Manuel
Supervised by:
  1. Francisco Javier Oliver Pozo Director

Defence university: Universidad de Granada

Fecha de defensa: 26 April 2021

Committee:
  1. María del Carmen Ruiz Ruiz Chair
  2. Francisco David Martín Oliva Secretary
  3. Marco A. Calzado Committee member
  4. Jesús María Paramio González Committee member
  5. Carmen Ruiz de Almodovar Egea Committee member

Type: Thesis

Abstract

El cáncer es una de las enfermedades más relevantes por su impacto social y económico. En 2018 se diagnosticaron 18,1 millones de nuevos casos y 9,6 millones de personas fallecieron a causa de la enfermedad. Teniendo en cuenta que se espera que para 2040 el número de enfermos aumente un 60%, y el de fallecidos un 70% con respecto a 2018. El interés por tratar la enfermedad es a día de hoy máximo. La enfermedad de cáncer implica la disrupción de las rutas de convivencia intercelular. La célula cancerosa va acumulando mutaciones que la embarcan en un proceso de desdiferenciación en el que las rutas de supervivencia unicelular se sobreexpresan y vuelven independientes de la regulación multicelular. Son objeto de esta Tesis Doctoral dos de las principales rutas de supervivencia; la respuesta a hipoxia; y la respuesta de daño al ADN. Durante la progresión tumoral es frecuente observar una inducción de estrés oxidativo, así como la aparición de áreas con baja concentración de oxígeno. En este microambiente agresivo se generan fuerzas selectivas en la que los clones que sobreexpresen ambas rutas garantizarán la supervivencia celular. La respuesta a la situación de hipoxia es uno de los principales eventos responsables de la malignización. Cuando un tumor crece más allá de unos pocos milímetros cúbicos se produce una limitación de oxígeno en las zonas centrales de la masa tumoral. En este contexto se produce la estabilización y activación de la familia de factores de transcripción denominados factores inducibles por hipoxia (HIFs, por sus siglas en inglés). Siendo HIF-1α uno de sus miembros más conocidos. Estos factores de transcripción inducen genes relacionados con la adaptación al contexto hipóxico como la activación de la angiogénesis, potenciación de la glucólisis, inhibición de la respiración oxidativa o represión global de la transcripción entre otros. Por otro lado, uno de los principales protagonistas de la DDR es la proteína PARP-1. Mediante el consumo de ATP y NAD+ se genera un polímero de poli(ADP-Ribosa) en respuesta a daño al ADN que une a distintas proteínas (incluída ella misma) modificando su actividad y estabilidad. PARP-1 se ha descrito participa en otras actividades independientes de la DDR como la regulación de la transcripción, la conformación de la cromatina o la respuesta a la inflamación entre otros. Tal como se indica en el título de esta Tesis Doctoral, en el presente trabajo exploraremos la “Relación entre las proteínas PARP-1 y HIF-1α durante la hipoxia tumoral”. Nuestro trabajo describimos la sobreexpresión de PARP-1 y HIF-1α en melanoma. Tanto a nivel de proteína en melanomas in situ, como a nivel de ARNm en melanomas cutáneo, uveal y acral. Por otro lado, analizamos en distintas líneas tumorales como al tratar con inhibidores de PARP o con PARP-1 silenciado, se produce la pérdida de estabilidad de HIF-1α . Lo contrario sucede al silenciar a la proteína PARG (que degrada el polímero), ello conduce al aumento a la estabilidad de HIF-1α. Mediante el uso de distintas sondas comprobamos en líneas tumorales y no tumorales cómo durante la hipoxia temprana se produce una inducción de ROS. El tratar con antioxidantes genera el mismo efecto que inhibir a PARP. Se inhibe en ambos casos la acumulación de polímero y la estabilidad y actividad de HIF-1α. Ello demuestra cómo la producción de ROS genera una activación de PARP-1 necesaria para la estabilización y activación de HIF-1α durante la hipoxia temprana. Estudios con distintos dominios de HIF-1α nos han permitido observar cómo es el dominio c-ter de HIF-1α el que es susceptible a la regulación vía PARP-1. Mediante ensayos de pull down e inmunoprecipitación demostramos cómo el dominio c-ter de HIF-1α se une al dominio de automodificación de PARP-1. Mediante un ensayo de PARilación in vitro comprobamos cómo, consecuencia de esta interacción física, el c-ter de HIF-1α es modificado por polímero en al menos dos secuencias de aminoácidos. Para concluir, hemos realizado un ensayo chIP-Seq en células con PARP-1 presente o PARP-1 K.O. Este ensayo nos permite observar cómo en ausencia de PARP-1, HIF-1α reduce su unión al ADN y cómo esta pérdida de reclutamiento sucede de forma dependiente de la función del gen. Del mismo modo observamos cómo la reducción de HIF-1α sucede en las zonas promotoras, especialmente una kilobase en torno al origen de transcripción del gen. Comprobamos también como, incluso cuando HIF-1α se une a sus promotores, la ausencia de PARP-1 impide la correcta expresión génica. Con todo ello, demostramos la existencia de una relación clara entre la DDR y la respuesta a hipoxia que consideramos merece seguir siendo investigada. Principalmente debido a su potencial utilidad clínica, al carecer la respuesta a hipoxia de inhibidores clínicos específicos mientras los inhibidores de PARP ya se encuentran aprobados en la clínica.