Caracterización y estudios metabolómicos de compuestos fenólicos bioactivos mediante técnicas separativas acopladas a espectrometría de masas

Resumen

En esta memoria se reúnen los resultados obtenidos durante la realización de la tesis doctoral titulada "Caracterización y estudios metabolómicos de compuestos fenólicos bioactivos mediante técnicas separativas acopladas a espectrometría de masas", donde se evalúa el potencial de Lippia citriodora y las hojas de Olea europaea como fuentes de compuestos fenólicos bioactivos para el desarrollo de nutracéuticos. La memoria se ha dividido en dos secciones: introducción y parte experimental. En la introducción se detallan, en primer lugar, las principales características de los nutracéuticos y las diferencias que existen entre éstos y los alimentos funcionales. A continuación, se describen las dos fuentes vegetales bajo estudio, Lippia citriodora y Olea europaea, las propiedades de los compuestos fenólicos (estructura, clasificación, efectos saludables, absorción y metabolismo) y el papel que juega la metabolómica en el estudio de estos compuestos. Por último, se describen las diferentes etapas del procedimiento analítico para la determinación de compuestos fenólicos que se han empleado en la parte experimental: tratamiento de muestra (tanto para muestras vegetales como biológicas), separación (CE, HPLC y nanoLC) y detección (absorción UV-Vis, IT-MS, TOF-MS y QTOF-MS). La parte experimental se divide en dos bloques que a su vez constan de tres capítulos cada uno: el primero centrado en la caracterización de las fuentes vegetales de compuestos fenólicos bajo estudio, es decir, Lippia citriodora y hoja de olivo, y el segundo aborda estudios de absorción y metabolismo de los compuestos fenólicos de dichas fuentes in vitro e in vivo mediante enfoques metabolómicos. El bloque I se ha centrado en la caracterización exhaustiva de los extractos de las dos fuentes de compuestos fenólicos bioactivos estudiadas, Lippia citriodora y las hojas de Olea europaea. En el capítulo 1, se emplea HPLC-DAD-ESI-TOF/IT-MS para estudiar la composición del extracto de Lippia citriodora. El uso de una columna de pequeño tamaño de partícula proporciona gran resolución, permitiendo la separación de varios isómeros. La información complementaria proporcionada por los distintos detectores, familia del compuesto indicada por los máximos de absorción, masas exactas y distribución isotópica proporcionada por el analizador TOF-MS y el patrón de fragmentación obtenido con el analizador IT-MS/MS, permiten la identificación tentativa de compuestos fenólicos en Lippia citriodora de los que no se dispone de patrones comerciales. Como continuación de este estudio, en el capítulo 2 se optimiza un método de CE-ESI-IT/TOF-MS para completar la caracterización del extracto de Lippia citriodora. Los principales parámetros electroforéticos así como los de la transferencia al analizador de masas se estudian de forma pormenorizada hasta conseguir la máxima resolución y sensibilidad. De esta forma, el método optimizado permite la identificación de algunos compuestos que no se habían caracterizado mediante el método cromatográfico descrito en el capítulo 1, demostrando la complementariedad de ambas técnicas separativas. Para finalizar el bloque, el capítulo 3, realizado en colaboración con el Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación del Consejo Superior de Investigaciones Científicas de Madrid, se centra en el estudio de la composición mediante HPLC-ESI-QTOF-MS de dos extractos de hoja de olivo obtenidos mediante PLE utilizando etanol y agua como disolventes de extracción. La elevada exactitud de masas y distribución isotópica tanto de los espectros de masas como de masas/masas proporcionada por el analizador QTOF-MS permite la identificación de un gran número de compuestos fenólicos en ambos extractos, incluyendo secoiridoides, fenoles simples, flavonoides, derivados de ácidos cinámicos y ácidos benzoicos. En el bloque II, llevado a cabo en colaboración con el Instituto de Biología Molecular y Celular (IBMC) de la Universidad Miguel Hernández, se estudia la absorción y metabolismo in vitro o in vivo de los compuestos fenólicos de ambos extractos mediante enfoques metabolómicos. En el capítulo 4 se evalúan diversos procedimientos de tratamiento de muestra y extracción para el análisis de compuestos fenólicos en plasma mediante nanoLC-ESI-TOF-MS, incluyendo precipitación de proteínas en diferentes condiciones, digestión enzimática y SPE utilizando diferentes fases sólidas y valores de pH. El procedimiento desarrollado se aplica al análisis de muestras de plasma de rata tras la administración del extracto de Lippia citriodora. En el capítulo 5, se estudia el efecto del extracto de Lippia citriodora sobre la actividad de las enzimas antioxidantes CAT, GPx y GRed en linfocitos, eritrocitos y neutrófilos, así como la actividad de MPO en neutrófilos (marcador inflamatorio del daño vascular) en ratas wistar tras la ingesta aguda del extracto. El efecto del mismo sobre estas actividades enzimáticas se correlaciona con los metabolitos identificados en plasma mediante HPLC-ESI-TOF-MS para intentar establecer qué compuesto o compuestos son los responsables de esta actividad y por tanto, los que podrían resultar de interés para el desarrollo de nutracéuticos. Por último, en el capítulo 6, se estudia la absorción de los compuestos fenólicos de hoja de olivo por parte de la línea celular de cáncer de mama SKBR3 para intentar establecer qué compuestos fenólicos son los responsables de la actividad citotóxica previamente mostrada en esta línea celular. Para ello, en primer lugar, el extracto de hoja de olivo se caracteriza cuantitativamente mediante HPLC-ESI-QTOF-MS, y a continuación se analiza mediante el mismo método el perfil metabólico del citoplasma de células SKBR3 incubadas con dicho extracto durante diferentes tiempos (15 min, 1, 2, 24 y 48 h). El trabajo experimental incluido en este capítulo se desarrolló durante una estancia de 4 meses en la sede de la empresa Bruker Daltonik en Bremen, Alemania.