Antileishmanial activity of Allicinmechanism of action, "in vivo" efficacy and value in combined therapy with Amphotericin B

Resumen

El principal sistema de control de la leishmaniosis es la quimioterapia. Los fármacosempleados en la terapéutica de esta enfermedad (antimoniales pentavalentes, iltefosina, paromomicina y anfotericina B) presentan importantes inconvenientes. El desarrollo de resistencias, la elevada toxicidad de algunos compuestos, la ausencia de cura parasitológica en todos los casos y el elevado coste de las preparaciones menos tóxicas y eficaces hacen de la I másD de nuevos agentes terapéuticos una necesidad urgente.En las fases iniciales en el cribado de moléculas de potencial interés se emplean modelos celulares. El método Alamar Blue es de bajo coste, fácil ejecución y toxicidad insignificante para las células. La modificación llevada a cabo por nosotros (atmósfera de 5 por ciento CO2-95por ciento aire sobre cultivos tamponados con 20 mM HEPES) ha permitido la obtención de resultados más precisos en el cribado de compuestos sobre promastigotes de Leishmania spp. Además, se ha desarrollado una modificación del método de infección que ha permitido obtener tasas de infección más elevadas con L.infantum y L.donovani.La alicina es una molécula de origen natural presente en plantas de la familia Alliaceae. La información existente acerca de su actividad de sobre Leishmania es escasa. La disponibilidad de alicina estabilizada permitió evaluar su potencial efecto antiproliferativo frente a los principales agentes causantes de la leishmaniosis visceral. Los resultados obtenidos han mostrado un efecto inhibitorio significativo de alicina a concentraciones micromolares sobre la multiplicación de promastigotes y amastigotes intracelulares de L.donovani y L.infantum, sin toxicidad para células de mamífero. Su administración en dosis repetidas cada 24 h incrementó significativamente su eficacia antiproliferativa. El valor de CI50 determinado, su bajo coste y escasa toxicidad podrían permitir su uso en terapia combinada.La combinación de alicina más AmB in vitro y ex vivo resultó de moderadamente sinérgica a sinérgica con concentraciones bajas de ambos compuestos, tanto frente a promastigotes como amastigotes. La relación dosis-efecto de dicha combinación fue analizada mediante la metodología de Chou-Talalay y el software CalcuSyn. Los resultados obtenidos in vitro y ex vivo fueron confirmados en un modelo experimental de leishmaniosis visceral en criceto. El tratamiento con alicina (5 mg-Kg-día, 5 días) eliminó la infección por L.infantum en 2 de los 6 animales tratados. Estos resultados han supuesto la primera evidencia de la actividad de alicina in vivo frente a las infecciones por Leishmania. La combinación de AmB (1 mg-Kg-día) más alicina (5 mg-Kg-día) redujo más del 95por ciento de la carga parasitaria de L. infantum, nivel de eficacia comparable (p menor que 0,05) a la obtenida con la dosificación estándar de AmB (5 mg-Kg-día).Dichos resultados sugieren la posibilidad de reducir cinco veces la dosis requerida de AmB en monoterapia sin pérdida de eficacia. Las dianas intracelulares de alicina en Leishmania son en gran parte desconocidas. Los estudios de microscopía electrónica de transmisión (MET) revelaron una alteración notable de la mitocondria. Alicina indujo una elevación de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el aumento de Ca2 más citosólico en Leishmania acompañados por la caída del potencial mitocondrial transmembrana y por la reducción de la producción de ATP. Los elevados niveles de ROS intramitocondriales junto a las alteraciones morfológicas observadas en MET apuntan a la mitocondria como diana primaria de alicina en Leishmania. El colapso de la membrana mitocondrial es un proceso irreversible que culmina con la muerte celular. Nuestros resultados no mostraron ninguna evidencia concluyente de muerte apoptótica y el ciclo celular se detuvo en la fase G2-M. Por tanto, nuestros resultados muestran que alicina induce la muerte de Leishmania mediante un proceso de necrosis celular.