Plegamiento "in vitro" de la rhbmp-2. Caracterización inicial del dímero activo mediante fluorescencia

Abstract

El desarrollo de la Ingenieria del ADN recombinante, y el conjunto de técnicas nacidas de la biología molecular que permiten manipular el genoma de un ser vivo, ha permitido la obtención de fragmentos de ADN portadores del gen o genes que se desee en cantidades ilimitadas (clonación de ADN recombinante). La expresión de genes clonados en bacterias, básicamente Escherichia coli, se ha usado ampliamente en la industria, para la producción de proteínas de uso farmacéutico, y en investigación, para realizar estudios bioquímicos y/o estructurales de las proteínas producidas. La bacteria puede producir una gran cantidad de proteína recombinante de forma rápida, a menudo con un bajo coste, mediante procesos a gran escala en fermentadores industriales, sin embargo, en muchos de estos procesos el producto de interés se deposita en forma de agregados insolubles e inactivos o en forma de cuerpos de inclusión. Por lo que es necesario realizar un proceso de plegamiento in vitro posterior para que la proteína adquiera sus actividad biológica. En esta tesis se ha abordado el estudio de la sustitución de urea por diferentes aditivos en el plegamiento in vitro de la BMP-2 humana expresada en escherichia coli. Esta proteína se caracteriza por ser un factor osteogenético que induce fenotipos osteoblásticos en células indiferenciadas. El estudio de dichos aditivos se realizó mediante la inducción de un marcador osteoblástico como es la actividad fosfatasa alcalina en una línea celular mioblástica, en concreto en la línea celular C2C12. Se investigó la presencia de diferentes aditivos evluándose la concentración de los mismos así como la concentración de proteína presente en el plegamiento y se compararon con los resultados obtenidos en presencia de urea, condición previamente establecida en nuestro laboratorio. Aquellas condiciones que presentaron resultados preliminares superiores a las condiciones control, se realizaron