Desarrollo de métodos de análisis para la cuantificación de disruptores endocrinos químicos en muestras biológicas

Laburpena

En la presente Tesis Doctoral se proponen varias metodologías para la determinación de diferentes disruptores endocrinos químicos en leche materna humana. El estudio se ha centrado principalmente en la aplicación de diversas técnicas de tratamiento de muestra y limpieza de extractos (clean-up) previo al análisis mediante cromatografía de líquidos o de gases acopladas a espectrometría de masas en tándem. En los últimos años, y debido a los cambios de hábitos experimentados por la sociedad, se han introducido en el mercado numerosas sustancias químicas de las cuales se dispone de muy poca información sobre su peligrosidad y sobre las consecuencias de su uso masivo. En muchos casos, se trata de compuestos que aparecen de forma ubícua en la actividad cotidiana del ser humano y por tanto en su entorno. Se ha demostrado que muchos de estos compuestos, además de presentar una importante actividad biológica presentan una gran capacidad de bioacumulación, debido a su bajo grado de metabolización en el cuerpo humano, por lo que se encuentran frecuentemente en fluidos y tejidos biológicos. La selección de los compuestos objeto de estudio en la presente Tesis Doctoral (bisfenol A y sus derivados clorados, parabenos y benzofenonas), se ha realizado en base a su producción mundial actual, alta exposición humana, y principalmente a su demostrada actividad como disruptores endocrinos. Como matriz objeto de estudio, se ha seleccionado la leche humana en base a que es una de las vías de exposición más importantes en la actualidad del ser humano en las primeras etapas de la vida, donde se ha detectado una mayor vulnerabilidad de los organismos a estos compuestos químicos. Además, la leche humana es un excelente biomarcador para determinar la exposición humana, ya que es una muestra muy fácil de obtener en cantidades relativamente elevadas. Dada la complejidad de esta matriz, y las dificultades que ofrece para su estudio desde un punto de vista analítico, la literatura científica demuestra una importante falta de metodologías para la determinación de estos compuestos en esta matriz, existiendo excasos métodos multirresiduo publicados hasta la fecha. Para resolver este problema, la investigación se ha centrado en la optimización y aplicación de diferentes técnicas de extracción y clean-up con el objetivo final de proponer y validar diversos métodos multirresiduo de buenas características analíticas, que permitan la determinación de los compuestos seleccionados en muestras de leche materna. Como técnicas de análisis se han empleado tanto la cromatografía de líquidos de ultrarresolución (UHPLC) como la cromatografía de gases (GC) acopladas a espectrometría de masas en tándem. Los métodos propuestos aportan notables mejoras y representan una importante innovación en cuanto a metodología analítica, cubriendo un amplio rango de disruptores endocrinos. Se ha llevado a cabo un estudio exhaustivo en esta matriz compleja de los parámetros más influyentes en los procedimientos de tratamiento de muestra y limpieza de extractos, empleándose en muchos casos la metodología multivariante de superficie de respuesta, y en la detección cromatográfica. Todos los métodos han sido validados siguiendo las guías internacionales de aplicación. Como resultado de la presente investigación, se han propuesto 6 nuevos métodos con grandes prestaciones analíticas en cuanto a exactitud (veracidad y precisión), sensibilidad y selectividad: A. Dos métodos multirresiduos para la determinación de bisfenol A y sus derivados clorados, parabenos y benzofenonas mediante el uso de la extración con barras agitadoras adsorbentes (SBSE), previa precipitación química de proteínas y grasas, y análisis mediante cromatografía de líquidos de ultrarresolución y cromatografía de gases acopladas a espectrometría de masas en tandem (UHPLC-MS/MS y GC-MS/MS). B. Método multirresiduo para la determinación de bisfenol A y sus derivados clorados, parabenos y benzofenonas mediante la aplicación de la extracción dispersiva con adsorbentes previa precipitación química de proteínas y grasas, y análisis mediante UHPLC-MS/MS. C. Método multirresiduo para la determinación de bisfenol A y parabenos mediante el uso de la extracción asistida con ultrasonidos previa al análisis mediante UHPLC-MS/MS. En esta metodología se incluye además un paso de limpieza del extracto con adsorbentes dispersivos (C18). D. Método multirresiduo para la determinación de benzofenonas mediante mediante UHPLC-MS/MS previo tratamiento de la muestra con extracción asistida por ultrasonidos y limpieza del extracto con adsorbentes dispersivos (C18 y PSA). E. Método multirresiduo para la determinación de parabenos mediante la aplicación de la microextracción sólido-líquido-líquido con membrana agitada (SM-SLLME) seguida de UHPLC-MS/MS. Los métodos propuestos han sido publicados o se encuentran en fase de publicación en diferentes revistas de impacto de la especialidad de Química Analítica, dos de ellos en Journal of Chromatography A, otros dos en Talanta y el último en la revista Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. Todas las metodologías propuestas han sido aplicadas a la determinación de los compuestos seleccionados en cada caso a muestras reales tomadas a partir de diferentes madres lactantes en diferentes momentos del proceso de lactancia. Como complemento al trabajo de laboratorio realizado, se ha publicado un artículo de revisión sobre la técnica stir bar sorptive extraction (SBSE) en la revista científica Talanta y un libro a modo de monografía editado por la Editorial Académica Española, titulado "Determinación de Disruptores Endocrinos Químicos en tejido placentario humano". Finalmente, durante el periodo de desarrollo de la presente tesis doctoral se ha colaborado, por necesidades puntuales del proyecto en el que se ha desarrollado la presente Tesis Doctoral, en el desarrollo de otros tres trabajos científicos publicados en revistas internacionales de alto impacto: A. F. Vela-Soria, I. Jiménez-Díaz, R. Rodríguez-Gómez, A. Zafra-Gómez, O. Ballesteros, A. Navalón, M.F. Fernández, N. Olea and J.L. Vílchez. Determination of Benzophenones in Human Placental Tissue Samples A by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Talanta 85 (2011) 1848-1855. DOI: 10.1016/j.talanta.2011.07.030 B. F. Vela-Soria, I. Jiménez-Díaz, R. Rodríguez-Gómez, A. Zafra-Gómez, O. Ballesteros, M.F. Fernández, N. Olea and A. Navalón. A Multiclass Method for Endocrine Disrupting Chemical Residue Analysis in Human Placental Tissue Samples by UHPLC-MS/MS. Analytical Methods, 3 (2011) 2073-2071. DOI: 10.1039/c1ay05162h C. J. Ballesta-Claver, R. Rodríguez-Gómez, L.F. Capitán-Vallvey. Disposable Biosensor Based on Cathodic Electrochemiluminescence of Tris(2,2-bipyridine)ruthenium(II) for Uric Acid Determination. Analytica Chimica Acta, 770 (2013) 153-160. DOI: 10.1016/j.aca.2013.01.045 En resumen, se han publicado un total de 10 trabajos científicos a modo de trabajo cientifico original, monografía o revisión en publicaciones de gran notoriedad e impacto a nivel internacional.