Desarrollo del sistema de cohesion intercelular en el epitelio corneal humano generado por ingenieria tisular. Estudio genetico e histologico

Resumen

La córnea es una estructura avascular, carente de vasos, a través de la cual la luz penetra en el ojo. Histológicamente, la córnea está compuesta de cinco capas: el epitelio, la membrana de Bowman, el estroma, la capa de Deséeme y el constituido por 6-8 capas de células epiteliales fuertemente cohesionadas mediante la presencia de abundantes uniones intercelulares, destacando los desmosomas y las uniones estrechas. La córnea humana puede verse afectada por la aparición de defectos de refracción que no pueden corregirse con medidas convencionales. En estos casos es preciso recurrir a los diferentes tipos de queratoplastias (queratoplastia penetrante, queratoplastia lamelar anterior y queratoplastia lamelar posterior). Sin embargo, todas estas técnicas presentan problemas como la escasez de donantes, la posibilidad de transmitir infecciones del donante al receptor y el riesgo de rechazo inmunológico. En la actualidad la única alternativa disponible al trasplante de córnea son las queratoprótesis, las cuales presentan un alto porcentaje de complicaciones. La generación de córneas humanas autólogas en laboratorio mediante ingeniería tisular supondrá un gran avance en este campo, pues estas córneas estarían exentas de las complicaciones efectos secundarios asociados al transplante corneal heterólogo. Para que las córneas artificiales sean funcionales, es importante analizar la estructura y el funcionamiento del epitelio de estas córneas, asegurando de este modo su funcionalidad y utilidad una vez implantadas in vivo. Los objetivos planteados al inicio de esta Tesis Doctoral fueron los siguientes: 1. Establecer y optimizar las condiciones de laboratorio para el cultivo de células epiteliales y estromales de la córnea humana. 2. Desarrollar en laboratorio un modelo parcial de córnea humana basado en biomateriales de fibrina humana y agarosa al 0,1%. 3. Identificar los mecanismos de cohesión intercelular del epitelio corneal mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica. 4. Identificar los genes vinculados a la diferenciación de los sistemas de cohesión intercelular epitelial mediante microarray. Para la fabricación de un equivalente cornal humano, en primer lugar se generaron cultivos primarios de células epiteliales esclerocorneales procedentes de queratoplastias penetrantes realizadas en los hospitales Virgen de las Nieves y San Cecilio de Granada. Posteriormente, se fabricaron matrices estromales de agarosa y fibrina humana al 0,1% para general sustitutos parciales de la córnea humana. Una vez fabricados, los equivalentes corneales fueron evaluados mediante microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido y transmisión y técnicas de inmunofluorescencia para proteínas que componen los desmosomas, utilizando para ello el microscopio láser confocal. Finalmente se cuantifico la expresión de genes implicados en la formación de diferentes tipos de uniones intercelulares mediante microarrays de oligonucleótidos. Los resultados de este estudio revelan la formación y maduración de un epitelio estratificado en la superficie de los constructos cornales. Por otro lado, el análisis microscópico puso de manifiesto la síntesis de varios tipos de uniones intercelulares, especialmente desmosomas, entre las células del epitelio cornal, teniendo éstos carácter maduro en los epitelios que alcanzaron estratificación (6-7 capas celulares). Del mismo modo, tanto el análisis a nivel de ARN mediante microarrays como el análisis a nivel de proteína mediante inmunofluorescencia con microscopía láser confocal mostraron la expresión de distintos componentes del desmosoma en las células del epitelio generado mediante ingeniería tisular en los constructos corneales humanos. En concreto, la expresión de desmoplaquina, desmogleína 3 y placoglobina 3 comenzó a evidenciarse de modo significativo cuando el epitelio alcanzó e estadio de 5-6 capas en cultivo sumergido, aunque en esta fase el patrón de expresión de estas proteínas fue diferente del patrón mostrado por las córneas humanas control, centrándose en las capas celulares más apicales en lugar de en las células alares centrales como ocurre en los controles. Finalmente, el cultivo aire-líquido de los sustitutos corneales se asoció a un patrón de expresión proteica muy similar al existente en las córneas control, generándose un sustituto corneal muy similar a la córnea humana normal. Todo lo anteriormente expuesto nos lleva a afirmar que la aplicación de las técnicas y los métodos de ingeniería tisular optimizados en esta Tesis Doctoral permiten la generación en laboratorio de un sustituto parcial de la córnea humana muy similar a la córnea nativa. La capa epitelial consta de un epitelio estratificado en el que las células están unidas entre sí mediante abundantes uniones intercelulares tipo desmosoma cuya distribución espacial es similar a la de las córneas normales únicamente cuando se utiliza la técnica de cultivo de aire líquido. Por todo ello, concluimos que las técnicas de cultivo celular y de ingeniería Tisular empleadas en este trabajo y detalladas en la presente Tesis Doctoral han hecho posible la elaboración de un sustituto de espesor parcial, compuesto de epitelio y estroma, muy similar a la córnea humana y sugiere que éste podría utilizarse clínicamente.