Identificacion de marcadores geneticos y epigeneticos en la diferenciacion y la refresion neuroblastica

Resumen

El neuroblastoma constituye el tumor sólido maligno extracraneal más frecuente de la infancia, representando aproximadamente el 40% de todos los tumores sólidos durante los cuatro primeros años de vida. Aunque el pronóstico depende de un gran número de factores, incluyendo el estadio clínico, la dad del paciente y una serie de características genéticas y moleculares del tumor, la supervivencia global de los pacientes afectos de este tipo de tumores continúa siendo muy baja. A pesar de ello, existe un elevado número de casos en los que el tumor, aun siendo maligno, es capaz de diferenciarse y regresar espontáneamente, especialmente en los estadios clínicos clasificados como "loco-regionales" o como "4S", desconociéndose en la actualidad los factores y marcadores genéticos y epigenéticos que se asocian a este fenómeno. La enorme variabilidad clínica y biológica del neuroblastoma hace necesaria la búsqueda de marcadores eficaces que permitan establecer predicciones pronósticas fiables a la hora de clasificar a los pacientes y definir la terapia a seguir. Los OBJETIVOS planteados al inicio de esta Tesis Doctoral fueron los siguientes: Objetivo general: Análisis de los marcadores carácter genético y epigenético que se asocian a la diferenciación celular y la regresión espontánea en tumores neuroblásticos humanos. Objetivos específicos: 1. Identificar la presencia de modificaciones epigenéticas del gen RASSF1 en tumores neuroblásticos humanos. 2. Determinar el valor pronóstico de la inactivación epigenética del gen RASSF1 en neuroblastoma y su asociación con regresión y diferenciación tumoral espontánea. 3. Cuantificar la expresión de genes relacionados con el complejo mayor de histocompatibilidad de clase I y II en tumores neuroblásticos de alto y bajo frado y en líneas celulares de neuroblastoma, mediante microarrays de oligonucleótidos. 4. Cuantificar la expresión de marcadores leucocitarios en tumores neuroblásticos de alto y bajo grado y en líneas celulares de neuroblastoma, mediante microarrays de oligonucleótidos. 5. Cuantificar la expresión de citocinas, interlucinas e interferones en tumores neuroblásticos de alto y bajo grado y en líneas celulares de neuroblastoma, mediante microarrays de oligonucleótidos. METODOLOGÍA: En la presente Tesis Doctoral se analizaron 108 tumores neuroblásticos humanos de todos los estadios, incluyendo neuroblastomas y ganglioneuromas. Para el análisis de expresión génica se utilizarán microarrays de oligonucleótidos de la casa comercial Affymetrix, los cuales incluyen más de 65.000 pruebas génicas humanas, incluyendo todos los genes y secuencias génicas conocidas, analizándose los genes más importantes del sistema inmunitario. En segundo lugar, se realizó un análisis epigenético para el gen RASSF1 mediante PCR específica de metilación (MSP), utilizando cebadores específicos para el promotor génico hipermetilado y no hipermetilado y mediante secuenciación de bisulfito. RESULTADOS Y CONCLUSIONES: El análisis epigenético de RASSF1 reveló que el promotor de este gen se encontraba hipermetilado en el 71,3% de los tumores analizados. Cuando se analizó el valor pronóstico de la hipermetilación de este gen, se encontró una tendencia no significativa hacia una mayor supervivencia en el grupo de pacientes con RASSF1 no hipermetilado, siendo estadísticamente significativa la asociación entre supervivencia e hipermetilación de RASSF1 cuando se consideraron únicamente los pacientes mayores de 1 año de edad al diagnóstico. Por otro lado, el análisis de expresión génica mediante microarray demostró una mayor expresión de los genes neuroblásticos con tendencia a la regresión espontánea en comparación con los tumores más agresivos y con tendencia a la progresión. Del mismo modo, numerosos genes que codifican para marcadores de linfocitos B y T, natural killer, macrófagos y leucocitos en general, así como para citocinas y receptores de interferones, se encontraron sobreexpresados en los tumores de menor agresividad. Finalmente, ciertas interleucinas se encontraron sobreexpresadas en los tumores más agresivos, mientras que otras se expresaron preferentemente en los tumores con tendencia a la regresión. La identificación de los mecanismos implicados en la diferenciación neuroblástica espontánea mediante los análisis epigenéticos y de expresión génica realizados en esta Tesis Doctoral podrían contribuir a un mejor conocimiento de los procesos genéticos y epigenéticos que dirigen el desarrollo del sistema nervioso humano. Por otro lado, el hallazgo de nuevos marcadores pronósticos en neuroblastoma (RASSF1) permitirá la optimización de los protocolos y terapéuticos actualmente existentes, facilitando la estratificación diagnóstica de los pacientes afectos de neuroblastoma y permitiendo una mejora del tratamiento.