Resistencias a antirretroviralesnuevos métodos de detección, nuevas aplicaciones

Résumé

En 1987 se produjo la entrada del primer fármaco antirretroviral VIH, con el paso de los años estos fármacos han mejorado tanto en efectos secundarios como en eficacia, sin embargo sigue preocupando la aparición de resistencias frente a los distintos fármacos. El estudio de resistencia antirretrovirales en pacientes VIH-1 se realiza mayormente mediante secuenciación poblacional o Sanger del gen pol, incluyendo las regiones Transcriptasa Reversa, Proteasa e Integrasa. Una limitación conocida de las pruebas de susceptibilidad a antirretrovirales es la falta de fiabilidad en la detección de variantes minoritarias de VIH-1 en la población del virus infectante. Esta limitación es particularmente importante en pacientes con antecedentes de tratamientos complejos y que han fracasado a una o varias líneas de fármacos antirretrovirales. Como alternativa, el análisis del ADN proviral puede tener interesantes aplicaciones, ya que permite detectar las mutaciones de resistencias archivadas en las poblaciones víricas, incluso tras la supresión del tratamiento. La detección de estas mutaciones de resistencia tiene gran relevancia clínica, como es la planificación de tratamiento antirretroviral en pacientes previamente tratados y con una limitada o nula disponibilidad de informes de resistencias previos. Durante los últimos seis años, Raltegravir (RAL), el primer inhibidor aprobado de transferencia de hebra de la Integrasa (INSTIs), ha tenido un papel importante en el tratamiento de la infección por VIH, tanto en pacientes naïves como en pretratados. Hoy en día, existen otros dos fármacos disponibles de la misma familia (Elvitegravir y Dolutegravir (DTG)), ampliando las opciones de utilización. Elvitegravir es un fármaco de primera generación, compartiendo el perfil de resistencias con RAL, por el contrario Dolutegravir, de segunda generación presenta una elevada potencia antiviral, con excelente perfil de eficacia y seguridad. Aunque con elevada barrera genética a la resistencia, este fármaco puede verse afectado por la combinación de algunas mutaciones de resistencia que se acumulan en el fracaso a RAL. DTG presenta una larga vida media plasmática, lo que le permite dosificarlo una vez al día. Esta dosificación es adecuada para los pacientes sin resistencia preexistente a INSTIs, por el contrario, en pacientes con mutaciones de resistencia documentadas en la Integrasa se debe administrar dos veces al día. En el capítulo 1, mostramos los resultados del estudio de 7 pacientes con historia de fracaso previo a un régimen que incluyera RAL y que posteriormente al fracaso consiguieran supresión virológica. La población a estudiar fue en su totalidad subtipo B, con una mediana de edad de 55 años. La mediana de carga viral y recuento de CD4 fue de 1,3 log10 cp/ml y de 765,5 cel/ml. La mediana (IQR) de tiempo entre el momento del fracaso y el estudio en ADN proviral fue de 48 meses (29-53). La mutación primaria N155H fue la más prevalente en el momento del fracaso, manteniéndose en el ADN proviral, al igual que las mutaciones accesorias, excepto en un paciente en el que hubo que recurrir a la secuenciación masiva, detectándose N155H en una proporción del 9,77%. En conclusión, a pesar de las limitaciones de nuestro estudio, que no deja de ser un estudio piloto que deberá ser corroborado en estudios posteriores, el estudio de las resistencias en la IN utilizando el ADN proviral de una muestra actual es un fiel reflejo de lo que ocurrió en el fracaso. De confirmarse estos resultados, esta herramienta podrá ser de gran utilidad para la toma de decisiones en la simplificación a DTG de este tipo de pacientes. A finales del año 2013 se incorporo la tecnología de secuenciación masiva (NGS) en algunos centros, mejorando la detección de variantes minoritarias. Existen ciertas diferencias entre la secuenciación tradicional Sanger y la secuenciación masiva, como es el umbral de detección de mutaciones: alrededor de 20% para Sanger y del <1% para masiva, además del volumen de secuencias obtenidos: una única secuencia Sanger frente a las miles de secuencias que ofrece la secuenciación masiva. El gran volumen de datos presentes en secuenciación masiva dificulta el trabajo bioinformático, necesitando potentes ordenadores, por lo que la simplificación hacia una única secuencia en ciertos casos, como estudios filogenéticos podría mejorar el flujo de trabajo. Además la convivencia entre tecnología Sanger y masiva hace necesaria una estandarización o unificación. En el capítulo 2 mostramos un método que permite simplificar los datos NGS a una secuencia consenso única, comparable a la secuenciación Sanger. Para el estudio se utilizaron secuencias de 62 pacientes naïve del periodo 2014-2015, nuevos diagnósticos VIH-1 referidos para estudios de resistencias a antirretrovirales en los servicios de Microbiología Clínica de el Hospital San Cecilio de Granada y del Hospital Clinic de Barcelona. Las secuencias tipo Sanger se obtuvieron utilizando el kit Trugene HIV-1. Para NGS se partió del mismo ARN, utilizando el kit GS V Type HIV-1 para 454 GS Junior. Las secuencias consenso NGS se generaron mediante el software Mesquite, seleccionando umbrales de corte del 10%, 15% y 20%. A continuación se construyeron arboles filogenéticos con Mega, con las distintas secuencias consenso NGS y sus respectivas Sanger, teniendo en cuenta valores de bootstrap mayores de 70% para definir una relación entre secuencias. Utilizando un punto de corte de 10% en las secuencias NGS, sólo en 17/62 pacientes las secuencias pareadas NGS-Sanger presentaron valores de bootstrap >70%, con una mediana (IQR) de los valores de bootstrap de 88% (83,5-95,5). Aumentando el umbral consenso NGS al 15%, estos valores ascienden hasta 36/62, relacionando las dos secuencias con un bootstrap >70%, mediana (IQR) de valores bootstrap de 94% (85.5-98). Por último, al utilizar un umbral de 20%, en 61/62 casos las secuencias pareadas NGS-Sanger se relacionan con bootstrap >70%, con una mediana (IQR) de los valores de bootstrap de 99% (98-100). En este último caso, en una única muestra no se relaciono la secuencia NGS con su Sanger debido a la multitud de diferencias entre algunas bases nucleotídicas entre ambas secuencias. Al 10%, las diferencias NGS-Sanger alcanzaron diferencias para influir en el subtipado en 3 pacientes, cambiando en un paciente desde subtipo B (NGS) a CRF01_AE (Sanger) y en dos pacientes desde subtipo B (NGS) a CRF02_AG (Sanger) respectivamente. Sin embargo, estas diferencias no se observaron al utilizar las secuencias consenso NGS al umbral 20%. Por lo tanto, presentamos una metodología que permite generar secuencias consenso que son representativas de la secuencia Sanger, para su uso en estudios de epidemiología molecular, siendo necesario efectuar un procesado de las secuencias y utilizar puntos de corte de al menos el 20%. Finalmente, varias investigaciones han estudiado la precisión de la tecnología NGS basada en pirosecuenciación, determinando la principal fuente de errores las regiones homopoliméricas, siendo mayoritarias inserciones y deleciones (indel). Además su curva de secuenciación presenta una disminución de la calidad al final del proceso. Por otra parte, la secuenciación VIH depende de la transcripción inversa y de la utilización de distintas PCR con el fin de aumentar la cantidad de genoma vírico, contribuyendo al aumento de los posibles errores en la secuenciación genómica. Estos artefactos producidos en PCR son bien conocidos, pudiendo minimizarlos mediante la optimización en las condiciones de amplificación y el uso de polimerasas de alta fidelidad. De otra forma, estos posibles errores pueden provocar un impacto significativo en diversos análisis, tales como montaje de secuencias, identificación de polimorfismos, identificación de subtipado vírico, estudios de mutaciones de resistencia y estudios de expresión génica. La mayoría de programas disponibles en las distintas plataformas proporcionan una tubería de control de calidad en el proceso de secuenciación, con el fin de filtrar la salida de secuencias, aun así, permanecen varios artefactos en el conjunto de datos. Por lo tanto, es aconsejable llevar a cabo un control de calidad final a nivel usuario, mediante filtrado de secuencias de alta calidad. Para ello se hizo una revisión sistemática sobre la eliminación de posibles errores en la plataforma 454 GS Junior. Identificamos siete estudios bajo los criterios de búsqueda, tres estudios de modificación de protocolo de amplificación y cuatro sobre programas bioinformáticos. Los estudios de modificación de protocolo en la PCR demostraron una disminución en el porcentaje de recombinación de hasta dos órdenes de magnitud para una PCR optimizada. Mediante los programas bioinformáticos se consiguió disminuir también los errores, el porcentaje de tasa de error disminuyo en un orden de magnitud, reducción de 93-98% de indel y una sensibilidad y especificidad en SNP variant calling cercanos a 1. La aplicación de estos métodos de corrección permitirá sin duda alguna ayudar a disminuir los posibles errores, asegurando las mutaciones observadas mediante NGS para el estudio de resistencias en pacientes VIH-1. Es necesaria la implantación de un flujo de trabajo que permita la eliminación de posibles errores.