Effect of statin treatment on periodontitis. Relationship between periodontitis and plasma lipids

Resumen

TESEO SUMMARY Background and objectives: The scientific evidence shows a possible association between hyperlipidaemia and periodontitis, being the inflammation the common component between these two conditions. It is postulated that statins seem to have an effect at periodontal level by three different mechanisms. Firstly, the lipid lowering effect with a consequent improvement in the lipid level, could have an influence on the general inflammatory status, as well as on periodontitis. Secondly, a direct anti-inflammatory action on the periodontium independent of lipid-lowering and, thirdly, an anabolic effect on bone, reducing resorption and even stimulating bone regeneration. The presented thesis is divided in two parts. The first part consisted on a clinical study which aimed to determine whether simvastatin consumption and hyperlipidaemia were associated with a worse periodontal condition, non-specific inflammatory mediators and specific bone activity biomarkers. The second part of the study, was an in vitro study that aimed to assess the expression of differentiation, proliferation and cellular activity markers on a cellular population of osteoblast cell line treated with simvastatin. Materials and Methods: The clinical study consisted on a double-blind observational and analytical cross-sectional study. 73 patients were divided into three groups: 1) simvastatin-treated patients with hyperlipidemia (n = 29); 2) patients with hyperlipidemia treated by diet alone (n = 28); and 3) normolipidaemic patients (controls, n = 16). Periodontal clinical variables of all participants were gathered, a blood sample was drawn from each to determine the lipid profile (total cholesterol, triglycerides, low-density lipoprotein, and high-density lipoprotein), serum levels of acute phase reactants (C-reactive protein), erythrocyte sedimentation rate, and bone metabolism markers (osteoprotegerin, osteocalcin, procollagen type I N-terminal propeptide, and C-terminal telopeptide of type I collagen). For the in vitro study, MG63 human osteosarcoma cells were cultured in the presence of simvastatin or solvent alone for 72 hours, and their proliferation was assessed by MTT assay. Cells from the culture were prepared for light, transmission and scanning electron microscopy studies. immunocytochemical was used to analyze the differentiation and proliferation markers Musashi-1, Ki-67, CD56 and CD44. All gathered data was analysed using descriptive, bivariate and multivariate methods to evaluate the association between exposure and effect, fitting the model by the different confounder variables. Results: Results from the clinical study showed that mean erythrocyte sedimentation rate was higher in the diet-treated patients with hyperlipidemia than in the normolipidaemic controls (P = 0.04). Serum osteoprotegerin concentrations were significantly higher in the simvastatin-treated patients with hyperlipidaemia than in the diet-treated patients with hyperlipidaemia (p=0.05). Multivariable linear regression analysis adjusted for age, sex, tobacco, and alcohol revealed that, compared with the normolipidaemic patients, the simvastatin-treated patients with hyperlipidemia showed a mean reduction of 0.8 mm (95% confidence interval = -1.5 to 0.0; p=0.05) in clinical attachment loss. The in vitro results in the cultured MG63 showed that control cells had spheroid morphology with numerous secretion vesicles accumulated on the surface, observing no cytoplasmic projections with intercellular connections. However, cells cultured with simvastatin had a polygonal and spindle-shaped morphology, with cytoplasmic projections that interconnected cells. There were numerous microvilli-like filamentous projections on the surface with no defined pattern. At 72 hours of culture, CD56, Ki-67 and Musashi-1 expression were significantly reduced (p<0.001) in simvastatin-treated cells. CD44 expression was intense in both groups and was not affected by simvastatin treatment. Conclusions: The results of the clinical study showed that the intake of simvastatin is associated with increased serum osteoprotegerin concentrations, and this could have a protective effect against bone breakdown and periodontal attachment loss. The baseline systemic inflammatory state of patients with hyperlipidemia was indicated by their increased erythrocyte sedimentation rate. Regarding the in vitro results, MG63 cells cultured with simvastatin for 72 hours underwent morphological and surface changes. Simvastatin treatment exerts antiproliferative and differentiating effects on these cells as well as promoting recovery of cellular homeostasis. Keywords: Cardiovascular risk, Hyperlipidaemia, Lipids, Lipoproteins, Periodontitis, Hydroxymethylglutaryl-CoA Reductase Inhibitors, Simvastatin, Inflammation, Osteoblasts. RESUMEN TESEO Introducción y objetivos: La evidencia científica ha mostrado una posible asociación entre la hiperlipemia y la periodontitis debido al componente inflamatorio que estas dos condiciones tienen en común. Así mismo, se ha postulado como las estatinas parecen tener un efecto a nivel periodontal que estaría mediado por tres mecanismos distintos. En primer lugar, el efecto hipolipemiante conllevaría una mejora en el perfil lipídico y, por tanto, en el estado inflamatorio general del sujeto y en la periodontitis. En segundo lugar, un efecto anti-inflamatorio directo sobre el periodonto independiente del efecto hipolipemiante y, en tercer lugar, un efecto anabólico sobre el hueso, reduciendo la reabsorción y estimulando la regeneración ósea. La presente tesis se divide en dos partes. La primera parte consiste en un estudio clínico cuyo objetivo fue determinar si la hiperlipemia y el consumo de simvastatina estaban asociados a una peor condición periodontal, así como a la expresión de marcadores de inflamación inespecíficos y marcadores de actividad ósea. La segunda parte consistió en un estudio in vitro con el objetivo de comprobar el efecto de un tratamiento con simvastatina sobre marcadores de proliferación, diferenciación y actividad celular en una línea osteoblástica. Material y métodos: El estudio clínico consistió en un diseño transversal observacional y analítico. 73 pacientes fueron divididos en tres grupos: 1) pacientes hiperlipémicos tratados con simvastatina (n = 29); 2) pacientes hiperlipémicos tratados solo con dieta (n = 28); y 3) pacientes controles normolipémicos (n = 16). Se registraron variables clínicas periodontales en todos los participantes, así como muestras de sangre para determinación del perfil lipídico (colesterol total, triglicéridos, lipoproteínas de baja densidad y lipoproteínas de alta densidad), niveles séricos de reactantes de fase aguda (proteína C reactiva), velocidad de sedimentación globular, y marcadores del metabolismo óseo (osteoprotegerina, osteocalcina, propéptido del procolágeno N-terminal tipo I y telopéptiodo C-terminal del colágeno tipo I). Para el estudio in vitro, células MG63 de osteosarcoma fueron cultivadas en presencia de simvastatina o sólo con el disolvente durante 72 horas. Se realizó una determinación de la proliferación mediante ensayo MTT. Tras el cultivo, las células fueron preparadas para estudio mediante microscopía óptica y electrónica de transmisión y barrido. Mediante técnica inmunocitoquímica se analizaron los marcadores de diferenciación y proliferación Musashi-1, Ki-67, CD56 y CD44. Todos los datos recogidos en ambos estudios fueron analizados de manera descriptiva y mediante técnicas bivariantes y multivariantes, para evaluar la asociación entre la exposición y el efecto, ajustando el modelo por las diferentes variables confundentes. Resultados: Los resultados del estudio clínico mostraron una velocidad de sedimentación globular mayor en los pacientes hiperlipémicos tratados solo con dieta frente a los controles normolipémicos (p=0.04). Las concentraciones de osteoprotegerina sérica fueron significativamente mayores en los pacientes hiperlipémicos tratados con simvastatina frente a los tratados solamente con dieta (p=0.05). El análisis de regresión multivariante ajustado por edad, sexo, consumo de tabaco y alcohol mostró que, comparado con los pacientes normolipémicos, los pacientes hiperlipémicos tratados con simvastatina mostraron una reducción de 0.8 mm (Intervalo de confianza 95%= -1.5 a 0.0; p=0.05) en los niveles de pérdida de inserción clínica. Los resultados del estudio in vitro mostraron como las células MG63 control presentaron una morfología esferoide con numerosas vesículas en superficie, y no presentaban proyecciones citoplasmáticas ni conexiones intercelulares. Por el contrario, las células MG63 cultivadas con simvastatina presentaron una morfología poligonal y fusiforme, con proyecciones citoplasmáticas interconectando células. Presentaban en superficie numerosas proyecciones filamentosas similares a microvilli sin un patrón definido. Tras 72 horas de cultivo, la expresión de CD56, Ki-67 y Musashi-1 se redujo de manera significativa (p<0.001) en las células tratadas con simvastatina. La expresión de CD44 fue intensa en ambos grupos y no se vio afectada por el tratamiento con simvastatina. Conclusiones: Los resultados del estudio clínico mostraron como el consume de simvastatina se asoció a unas concentraciones séricas superiores de osteoprotegerina. Esto podría implicar un efecto protector frente a la destrucción ósea y la pérdida de inserción periodontal. Los pacientes con hiperlipemia mostraron un estado inflamatorio basal reflejado en una mayor velocidad de sedimentación globular. Con respecto a los resultados in vitro, las células MG63 cultivadas en simvastatina durante 72 horas sufrieron cambios morfológicos y de superficie. El tratamiento con simvastatina ejerció efectos antiproliferativos y diferenciadores en estas células, promoviendo la recuperación de la homeostasis celular. Palabras clave: Cardiovascular risk, Hyperlipidaemia, Lipids, Lipoproteins, Periodontitis, Hydroxymethylglutaryl-CoA Reductase Inhibitors, Simvastatin, Inflammation, Osteoblasts.