Modulación mutacional de proteínasingeniería de proteínas morfogenéticas de hueso y enzimas ancestrales resucitadas

Resumo

En la presente Tesis Doctoral hemos abordado diferentes trabajos de relevancia en ingeniería de proteínas. En un primer bloque tomamos como objeto de estudio la Proteína Morfogenética de Hueso 2 (BMP-2 de sus siglas en inglés) que, por su capacidad para inducir regeneración ósea, es una proteína de gran interés en el campo de la biomedicina. Por ello, hemos explorado la posibilidad de utilizar la información evolutiva contenida en los alineamientos de secuencias, para la obtención de variantes de BMP-2 con su función biológica mejorada. Para nuestro propósito, hemos planteado un modelo simple basado en la estadística de la selección natural purificadora obteniendo diferentes variantes de BMP-2. Para testar su actividad hemos llevado a cabo ensayos celulares basados en la detección de la actividad fosfatasa alcalina asociado al fenotipo osteoblástico inducido. Aunque los resultados obtenidos son prometedores, hemos encontrado dificultades en su interpretación asociadas a un cierto nivel de irreproducibilidad inherente al procedimiento de purificación usado. Por ello, este trabajo se encuentra actualmente en desarrollo, ya que se está trabajando en un nuevo sistema de producción de proteína, necesario para el estudio riguroso de las variantes obtenidas. En un segundo bloque, hemos estudiado tiorredoxinas ancestrales, con el objetivo general de explorar el potencial de proteínas precámbricas resucitadas en ingeniería de proteínas. En primer lugar, hemos abordado los factores que determinan la muy alta estabilidad de estas proteínas ancestrales, tomando como objeto de estudio específico la tiorredoxina perteneciente al último ancestro común de cianobaterias y los grupos de deinococus y thermus (trx-LPBCA) por ser la más estable de las resucitadas. Así, para analizar los factores que determinan su inusual estabilidad, hemos realizado un estudio mutacional detallado con objeto de caracterizar su estabilidad termodinámica y cinética. Este estudio nos guió con éxito en la búsqueda de mutaciones estabilizantes y además nos permitió concluir que la naturaleza de la estabilización de la trx-LPBCA con respecto a la tiorredoxina moderna de E. coli es fundamentalmente entrópica, reflejando posiblemente la menor entropía conformacional en el estado desplegado de la proteína ancestral asociada a la eliminación de residuos de glicina y a la introducción de residuos de prolinas. Como resultados de estos estudios, sugerimos que la correlación estabilidad/evolución no refleja, al menos para la tiorredoxina, la selección natural de la estabilidad termodinámica por sí misma, sino de otro factor que está asociado a ésta. Proponemos, apoyándonos en el estudio cinético comparativo realizado entre la trx-LPBCA y su análoga actual, la tiorredoxina de E. coli, que dicho factor es la estabilidad cinética. En el trascurso de este trabajo, obtuvimos resultados experimentales que parecían indicar una desnaturalización fría no cooperativa en la trx-LPBCA y que sugerían la posibilidad de que las tiorredoxinas ancestrales resucitadas nos pudieran permitir abordar el problema de la evolución de la cooperatividad. Esta posibilidad sin embargo no se confirmó, ya que hemos encontrado el mismo patrón en la desnaturalización fría en la tiorredoxina de E. coli y, además, lo hemos podido explicar en base a la lentitud de la cinética de desplegamiento a baja temperatura. Proponemos por tanto, apoyándonos en los resultados obtenidos, que la estabilización cinética a baja temperatura podría jugar un papel primordial en la adaptación al frío de organismos psicrófilos. Por último, hemos realizado lo que posiblemente sea el primer trabajo de ingeniería de proteínas que toma como punto de partida una enzima ancestral resucitada. En concreto, hemos investigado la posibilidad de rediseñar el centro activo de la trx-LPBCA, mediante el estudio de una biblioteca combinatorial de variantes proteicas, cuyas mutaciones fueron propuestas por criterios estructurales. En cuanto a la metodología utilizada, cabe resaltar la aplicación de una técnica de regresión multivariante, la llamada regresión por mínimos cuadrados parciales, que nos permite, con el estudio de unas pocas variantes modelar la relación entre genotipo y fenotipo, y de esta manera inferir el comportamiento de toda un biblioteca y por ende, acceder a las mejores variantes. En cuanto al objetivo específico abordado, hemos demostrado como el efecto de un residuo enterrado, esencial para la catálisis enzimática, puede sustituirse por el efecto de un residuo expuesto al solvente. Creemos que este resultado puede tener implicaciones para la ingeniería de sitios activos de novo, ya que mientras que el diseño de grupos enterrados implicados en catálisis es extremadamente difícil, el cribado de una biblioteca basada en mutaciones expuestas no debe ofrecer grandes dificultades, en particular si la biblioteca se ha construido sobre una variante hiper-estable, como es el caso de proteínas precámbricas resucitadas.