Nuevos aspectos estructurales y funcionales de los dominios I al VI de la región 5ª del RNA del virus de la hepatitis C

Resumen

El virus de la hepatitis C (HCV) es un virus hepatotrópico, perteneciente al género Hepacivirus dentro de la familia Flaviviridae. Infecta a más de 185 millones de personas en el mundo y ha sido reconocido como la principal causa de infección hepática crónica en humanos. HCV es un virus envuelto, que contiene un genoma de RNA de cadena sencilla y polaridad positiva, que presenta un único marco de lectura abierto de 9.6 Kb flanqueado por dos regiones no traducible (UTR) en sus extremos 5' y 3'. En la región 5'-UTR se encuentra un elemento para la entrada interna del ribosoma (IRES), constituido por varios dominios estructurales muy conservados, esenciales para el reclutamiento interno del ribosoma en la traducción independiente de 5'-cap. Mediante ensayos de corte con la RNasa P se determinó que el dominio IV del IRES incluye un motivo estructural tipo-tRNA, en torno al codón de inicio de la traducción AUG. En el dominio II del IRES se encuentran dos bucles-E, altamente sensibles a la radiación UV y uno de ellos es responsable del doblamiento del dominio hacía el dominio IV, favoreciendo el posicionamiento del codón AUG en el surco de descodificación en la subunidad ribosomal 40S en el inicio de traducción. En el desarrollo de esta Tesis, se ha trabajado con el fragmento 1-570 del RNA de HCV, que incluye toda la región 5'-UTR y el primer tercio de la secuencia que codifica para la proteína core. En trabajos previos de este laboratorio se determinó, mediante ensayos de corte de la RNasa III, que la secuencia comprendida entre los dominios I y II del 5'-UTR, interacciona con la secuencia basal del dominio VI (428-442) formando un anillamiento a larga distancia que deja al IRES en una forma cerrada. En este trabajo se ha estudiado los efectos del magnesio en los cambios conformacionales que experimenta este fragmento del RNA de HCV. Se demostró mediante ensayos de corte con la RNasa T1 en condiciones nativas y mediante ensayos de movilidad electroforética en geles nativos, que el magnesio es esencial en la formación de estructuras terciarias en el IRES, como la formación del pseudonudo ya descrito con anterioridad, y en la formación y estabilidad de la forma cerrada que experimenta el IRES en presencia de sus secuencias flanqueantes (dominios I y V-VI), a una concentración final de magnesio entre 0-2 mM. A continuación nos focalizamos en el microRNA hepático miR-122, relacionado con el tropismo, la estabilidad, la replicación y la traducción del virus. El miR-122 presenta dos dianas ampliamente estudiadas entre los dominios I y II (S1 y S2). Recientemente, una tercera diana (S3) fue preliminarmente descrita en el dominio IV, incluyendo al codón AUG, sin función, parámetros termodinámicos o cinéticos aún determinados; y una cuarta diana (S4) en el dominio V, fue descrita por nosotros en la elaboración de este trabajo. Formando dos sitios de unión en tándem a ambos flancos del IRES, la unión del miR-122 en cada flanco presentó diferencias termodinámicas y cinéticas. Las dianas localizadas en el flanco 3' del IRES (S3 y S4) interaccionaron con menor afinidad, pero con mayor rapidez que en las dianas del flanco 5' (S1 y S2). De manera que, aparte del cambio conformacional de la forma abierta a cerrada por la formación del anillamiento a larga distancia, la interacción directa del miR-122 en el flanco 3' del IRES (S3) es capaz de provocar un cambio conformacional local, desestabilizando el tallo del dominio IV. Por tanto, el mir-122 presentaría un efecto opuesto al magnesio, en lo que respecta este cambio conformacional. La aparición de la forma cerrada en presencia del miR-122, necesitó una concentración superior de magnesio (3 mM). El cambio conformacional observado en geles nativos, tanto en presencia como en ausencia de miR-122, o bien de Mg2+, se ha correlacionado con dos formas de migración del RNA 1-570 incubado con la subunidad 40S, una rápida y otra lenta. Indicativo de que las formas cerradas y abiertas del RNA, interaccionan de manera distinta con el ribosoma. Mediante ensayos de digestión total con la RNasa A se detectaron diferencias en las regiones del RNA-HCV que interaccionan con la subunidad 40S entre las formas abierta y cerrada. Concretamente, en la forma abierta estarían protegidos de la RNasa A los dominios II y III, mientras que en la forma cerrada únicamente el dominio III. Mediante ensayos de corte con RNasas específicas de estructuras tipo-tRNA (RNasas P y RNasa Z), hemos detectado mayor rendimiento de corte de la RNasa P humana en la estructura tipo-tRNA en el fragmento del RNA de HCV que presenta la forma cerrada (HCV1-570). Sin embargo, la presencia del miR-122 en la reacción de la RNasa P humana, contribuyó negativamente en el corte de la forma cerrada, mientras que los fragmentos que no presentaron anillamiento a larga distancia incrementaron su accesibilidad. Otro elemento estructural a resaltar en el IRES de HCV, fueron los bucles-E presentes en el dominio II del IRES. Ante la irradiación con UV-C, ambos bucles-E formaron un enlace covalente (crosslink) entre las cadenas opuestas. presumiblemente, mostrándose como dos productos de migración retardada en geles de poliacrilamida desnaturalizante. Sorprendentemente, la radiación de la luz UV-C (254 nm) en el bucle-E apical provocó un auto-corte específico del RNA-HCV en las posiciones U78 y C79, mediante un mecanismo oxidativo independiente de la generación de radicales libres del medio, obteniéndose mayoritariamente una serie de productos con nuevos extremos generados 5'P y 3'P, y en menor medida 3'OH. La generación de un auto-corte específico por acción de la radiación UV se demostró también en el dominio Ib del IRES del RNA del virus de la peste porcina clásica (CSFV) en las posiciones C43 y U44, indicando que no se trata de un fenómeno exclusivo del RNA de HCV. Cada una de las estructuras que componen la región en estudio, 1-570 del RNA de HCV, serían una serie de señales que son reconocidas de manera específica por los diferentes factores biológicos que se encuentran dentro de la célula. De manera que la especificidad que presentan esos elementos celulares por las diferentes estructuras presentes en los RNAs virales es la información que resulta de interés.