Desarrollo de nuevas fases sensoras ópticas para el control de oxígeno molecular con aplicaciones biotecnologicas, industriales y clínicas

Abstract

La presente Memoria presenta los resultados obtenidos durante la realización de la Tesis Doctoral titulada "Desarrollo de nuevas fases sensoras ópticas para el control de oxígeno molecular con aplicaciones biotecnológicas, industriales y clínicas". La Memoria se ha dividido en dos secciones principales: introducción y parte experimental. La introducción recoge, en primer lugar, una visión general de la importancia de la determinación de oxígeno en diferentes campos de la Ciencia, así como las técnicas existentes para realizar dicha determinación. En segundo lugar, se detalla más información sobre la determinación de oxígeno por atenuación de la luminiscencia y el diseño de fases sensoras ópticas. Para ello, se describen tanto los fundamentos de la luminiscencia molecular como los diferentes métodos existentes para su detección, haciendo un especial hincapié sobre las partes que componen un sensor óptico y sus diferentes configuraciones. Tras estas nociones sobre sensores ópticos de oxígeno se describen los componentes de la fase sensora: indicador y matriz; señalando cuales son los materiales más utilizados en el desarrollo de fases sensoras ópticas de oxígeno, algunas de sus características y como éstas influyen sobre la sensibilidad de la fase sensora obtenida. En el último apartado de la introducción se resume la importancia de los sensores ópticos de oxígeno, resaltando aspectos generales del diseño y la caracterización, los motivos que han impulsado el desarrollo de estos dispositivos, así como sus ventajas e inconvenientes. Por último se realiza una revisión sobre las aplicaciones más relevantes que utilizan la atenuación de la luminiscencia para obtener información de importancia analítica sobre paramétros de diferente naturaleza. La segunda parte, denominada experimental, recoge los resultados obtenidos durante la realización de la presente Tesis Doctoral y la discusión de los mismos; se divide en cuatro bloques (cada uno compuesto de uno o dos capítulos) con una breve introducción sobre la temática y consideraciones más importantes. El primer bloque se centra en la caracterización de fases sensoras ópticas basadas en complejos de Ir(III) depositados en membranas poliméricas de diferente viscosidad, así como en el soporte nanoestructurado. Este bloque fue desarrollado en colaboración con el Laboratory for Photonics and Interfaces del Institute of Chemical Sciences and Engineering del École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) en Suiza y recoge la caracterización de nuevos complejos de iridio con diferentes combinaciones de ligandos derivados de la piridina que emiten a longitudes de onda comprendidas entre 470 nm y 625 nm. En total se han caracterizado 4 complejos catiónicos y 3 complejos neutros. Estos complejos fueron depositados sobre poliestireno con diferentes cantidades de plastificante y sobre un soporte nanoestructurado basado en óxido hidróxido de aluminio. Para la evaluación de las fases sensoras y su compatibilidad con los soportes en función de las características del complejo, se determinaron sus constantes de Stern-Volmer, rendimientos cuánticos de luminiscencia y tiempo de respuesta; los complejos mostraron una alta sensibilidad a oxígeno para bajas concentraciones cuando son incorporados a la matriz de óxido hidróxido de aluminio. Los resultados obtenidos de esta caracterización se muestran en los Capítulos 1 y 2. El segundo bloque versa sobre la importancia del desarrollo de fases sensoras ópticas con propiedades específicas. Este control de propiedades puede hacerse atendiendo a dos aspectos: la síntesis de materiales a la carta o el control sobre las propiedades morfológicas de la fase sensora. Así, en el Capítulo 3 se llevó a cabo una revisión bibliográfica de la técnica de polimerización radical controlada como herramienta para la obtención de nuevos materiales con propiedades especificas que potencien su aplicación en el desarrollo de fases sensoras ópticas. Y en el Capítulo 4 se aplica un diseño de experimentos basados en la metodología de superficies de respuesta (RSM) para modelizar el tamaño y polidispersidad de nanopartículas poliméricas obtenidas mediante el método de miniemulsión-evaporación. Este trabajo fue realizado en colaboración con el Departamento de Química Analítica de la Universidad de Extremadura. La aplicación de esta metodología resulta útil para simplificar la búsqueda de las condiciones experimentales que dan lugar a nanopartículas con un determinado valor de tamaño y polidispersidad, y puede hacerse extensible a la modelización de otros parámetros. Además, la metodología de superficies de respuesta permite obtener un catalogo de tamaños y polidispersidad realizando un mínimo número de experimentos. En concreto, el modelo obtenido fue aplicado en el desarrollo de nanopartículas híbridas de poli(estireno-co-anhídrido maleico) y magnetita que poseían el indicador de oxígeno (pentafluorofenilporirina de Pt(II), (PtTFPP)) encapsulado en su interior, con la intención de producir nanopartículas que fueran fácilmente recolectables con un imán. Para ello, se fijó un tamaño objetivo de 200 nm y la mínima polidispersidad alcanzable por las condiciones experimentales. De este modo, haciendo uso de Matlab y las ecuaciones obtenidas de la aplicación del RSM, se encontraron las condiciones de síntesis (concentración de polímero y volumen de disolvente) más adecuadas para obtener dicho tamaño de partícula en polímeros de tres pesos moleculares diferentes. El tercer bloque se llevó a cabo en colaboración con el Swiss Federal Institute of Technology de Zurich (ETH Zurich), Suiza. El contenido de este bloque está relacionado con el desarrollo de un sensor inalámbrico para determinación de oxígeno en líquido ocular. Así, en el Capítulo 5 se comparan dos fase sensoras, una membrana clásica y otra particulada, basadas en poliestireno y el complejo octaetilporifirina de Pt(II). Ambas tipos de fases son depositadas sobre un chip recubierto de oro que simula la superficie del sensor intraocular usado para esta aplicación. La comparación de su sensibilidad y tiempo de respuesta muestran las ventajas que ofrece la Nanotecnología para disminuir el tiempo de respuesta. A continuación, en el Capítulo 6 se desarrolla un método de deposición de estas partículas basado en la deposición electroforética, lo que no solo permite el control sobre la deposición de la fase sensora sino que también permite la deposición en superficies micrométricas no planas. Para desarrollar este método se optimizó, en primer lugar, la síntesis de nanopartículas mediante precipitación-evaporación con el complejo PtTFPP encapsulado físicamente, y se acotó el intervalo óptimo de voltaje y tiempo para llevar a cabo la deposición. A continuación se realizó la deposición electroforética sobre diferentes chips de oro, a diferentes tiempos y voltajes, y se analizaron las propiedades de las fases sensoras, mostrando una buena sensibilidad a oxígeno. Además, el tiempo de respuesta de las fases varió entre 4 y 8 segundos, lo cual es importante en aplicaciones in vivo. El análisis de los chips mediante microscopia electrónica de barrido también proporcionó información sobre la cantidad de partículas depositadas (mayor cantidad para tiempo y voltajes mayores). El agarre de las partículas sobre la superficie de oro fue evaluado haciendo pasar un flujo de agua durante 12 horas, demostrando la aplicabilidad de esta técnica de deposición para la generación de fases sensoras ópticas. Por último el bloque 4, que consta de un único capítulo, se dedica íntegramente al desarrollo de un biosensor de glucosa con transducción óptica de oxígeno. Así, en el Capítulo 7 se desarrolla una fase sensora sensible a glucosa mediante la deposición electroforética de la enzima glucosa oxidasa y nanopartículas poliméricas que contenían el indicador PtTFPP covalentemente unido. La síntesis del polímero indicador se llevó a cabo en el Institute of Analytical Chemistry and Food Chemistry de la Graz University of Technology de Graz (Austria), a partir de un polímero y complejo comerciales y condiciones suaves de reacción. Las nanopartículas obtenidas por precipitación-evaporación a partir de este polímero fueron depositadas sobre un chip de oro junto con la enzima siguiendo varias estrategias (concentración, voltaje y tiempo aplicado, orden de deposición de los diferentes reactivos). El chip que mostró una mejor respuesta fue evaluado frente a diferentes concentraciones de glucosa, mostrando una buena sensibilidad para concentraciones entre 0.5 y 3 mM. Estos resultados también demuestran la idoneidad de la deposición electroforética para el desarrollo de biosensores con transducción óptica.