Respuestas celulares a modificaciones en el perfil lipídico de membrana y a la presencia de un antioxidante del aceite de oliva en un modelo in vitro de pancreatitis aguda. Aspectos inflamatorios

Resumen

Dieta mediterránea y procesos oxidativo-inflamatorios. Mecanismos celulares implicados en el desarrollo de enfermedades oxidativo-inflamatorias. Papel de los componentes de la dieta mediterránea. RESUMEN Un gran número de estudios epidemiológicos han mostrado que las poblaciones que viven alrededor del Mediterráneo tienen una baja incidencia de enfermedades crónicas con etiología oxidativo-inflamatoria, como por ejemplo enfermedades cardiovasculares, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, cáncer, etc. en comparación con poblaciones del norte de Europa (Keys 1980; Trichopoulou 1999). Parece demostrado que la dieta Mediterránea tiene efectos beneficiosos para la salud, y estos son en parte consecuencia del alto contenido en ácidos grasos monoinsaturados (MUFAs, que constituyen un 85% del aceite de oliva), en compuestos fenólicos antioxidantes (como el hidroxitirosol) y en ácidos grasos poliinsaturados ¿-3 (PUFAs ¿-3). Su actuación en la atenuación de procesos oxidativos e inflamatorios parece realizarse mediante la inhibición de la expresión de citocinas, reducción de su actividad y modificación de señales intracelulares entre otros (Wahle et al. 2004). Sin descartar otras posibilidades, el mecanismo principal del efecto antiinflamatorio del aceite de oliva y la grasa de pescado se debe a la incorporación de los ácidos grasos dietéticos en las membranas biológicas y a las propiedades que esto confiere a la célula. De hecho, trabajos realizadas anteriormente por nuestro grupo, han puesto de manifiesto la influencia de la composición de los lípidos dietético en las membranas de las células acinares pancreáticas (Santana et al., 2009), así como el efecto de la modificación del perfil lipídico de membrana en aspectos funcionales de la células, tanto en modelos in vivo (Martinez et al., 2004; Yago et al., 2004) como in vitro (López-Millán et al., 2009). Es interesante resaltar que, mientras que el papel de los ácidos grasos y antioxidantes ha sido ampliamente estudiado en otras enfermedades con componente inflamatorio como la aterosclerosis, artritis reumatoide o colitis ulcerosa, apenas se ha investigado el efecto de estos compuestos en la pancreatitis aguda. Los pocos trabajos publicados sobre este asunto se centran en evaluar la eficacia terapéutica de la administración de ácidos grasos/fitoquímicos con pancreatitis ya establecida. Sin embargo, no existen trabajos en los que se examine la influencia de estos componentes de la dieta desde un punto de vista preventivo, es decir, mediante un modelo experimental en el que el daño se induce a posteriori, tras el tratamiento previo con los componentes nutricionales. Entre los distintos modelos animales de pancreatitis experimental que podemos encontrar en bibliografía, nosotros utilizamos la producida por estimulación supramáxima con ceruleína, que es el modelo experimental más usado tanto in vivo como in vitro debido a sus similitudes bioquímicas, morfológicas y fisiopatológicas con varios aspectos de la pancreatitis humana. Nuestro modelo experimental in vitro utiliza la línea celular AR42J, única línea celular actualmente disponible que mantiene muchas características de las células acinares pancreáticas normales. Pero son diferentes de las células acinares normales por varias razones: 1) proliferan rápidamente; 2) sintetizan, almacenas, y secretan enzimas digestivas pero la regulación de su función exocrina es anormal, y 3) poseen una vía adicional de regulación neuroendocrina. Por esto, un aspecto importante de esta Tesis es la utilización de dexametasona para diferenciarlas hacia un fenotipo exocrino (Audi et al.,2007). En principio pretendemos determinar un modelo in vitro de pancreatitis aguda en células AR42J diferenciadas, a través del estudio de la respuesta inflamatorios y funcional que presenta la célula después de tratarla con un agente nocivo como es la ceruleina. En segundo lugar, evaluar el efecto que puede tener el pretratamiento con un compuesto fenólico, hidroxitirosol (HT) en este modelo de pancreatitis in vitro. Por último, evaluar el efecto de la modificación del perfil lipídico de la membrana de células AR42J diferenciadas, enriqueciéndolas en MUFAs o en PUFAs n-3, en este modelo de pancreatitis aguda, al igual que el estudio del pretratamiento con HT y de la existencia de posibles interacciones o potenciación entre ambos factores, perfil lipídico y/o la presencia de HT. MATERIALES Y MÉTODOS La línea celular derivada de pancreatoma de rata AR42J, procedente de la Colección Europea de Células Animales en Cultivo (ref. ECACC nº 93100618), fue suministrada por el Banco de Células del Centro de Instrumentación Científica de la Universidad de Granada. Previamente a su uso las células se diferenciaron por incorporación en el medio de cultivo de Dexametasona 100nM (Dxm) durante 72 horas. Junto con la Dxm se incorporaron los ácidos grasos a través de la adición, al medio de cultivo, del suero enriquecido con ácido oleico (50 µM) o con la mezcla EPA/DHA (EPA 15 µM y DHA 10 µM), según lo descrito por Audi y colaboradores (2007). De este modo se obtuvieron tres grupos experimentales de membrana, células AR42J diferenciadas con membranas no modificadas (NM), células AR42J diferenciadas con membranas modificadas en oleico (MO), y células AR42J diferenciadas con membranas modificadas en PUFAs n-3 (Mn-3). Pasadas las 72 h se retiró el medio de cultivo y se incubaron las siguientes 26 h con los respectivos tratamientos, (+/-) HT 50 µM y/o (+/-) Ceruleina (Ce) 10-8 M. En el caso de la ceruleina, se añadió en las últimas 24 h. por lo que de cada grupo experimental de membrana que se obtuvo anteriormente, a su vez resultaron 4 grupos de tratamientos por membrana, resultando en un total de 12 grupos experimentales. Excepcionalmente, para algunos parámetros, además del tratamiento con ceruleina 10-8 M se incubaron también con ceruleina 10-7 M, en este caso se especificará como Ce-8 o Ce-7 respectivamente. El análisis de los ácidos grasos de membrana se llevó a cabo mediantes cromatografía gas-liquida, con el fin de confirmar que la membrana se había enriquecido en los ácidos grasos correspondientes. La respuesta inflamatoria de la célula acinar se realizó por un lado mediante la determinación de la activación del factor de transcripción NFkB a través de la cuantificación de la concentración citosólica de IkB¿ por la técnica de western blot (anticuerpo IkB¿ de Cell signalling, dilución 1:500. Alternatively, detection and quantification of protein were performed using Odyssey Image Scanner System (Licor Biosciences, Cambridge, UK) using IRdye-conjugated secondary antibodies (Licor) and the Odyssey quantification software.) Y los niveles nucleares de p65 por el kit comercial TransAMTM NFkB Chem p65/p50/p52 de Activ Motif. La extracción nuclear y citoplasmática se realizó por el kit comercial Nuclear Extract Kit de Active Motif; Por otro lado se determinó la concentración de citocinas IL-10, IL-6, IL-1ß, y TNF¿, en el medio por el Kit MILLIPLEXTMMAP RAT CYTOQUINE/CHEMOKINE 96 Well Plate Assay de Millipore, basado en la Tecnología Luminex® xMAP® de Corporation. Los mecanismos de muerte celular apoptosis/necrosis se determinaron mediante cartometría de flujo, usando el kit comercial de ANNEXIN V-FITC APOPTOSIS DETECTION KIT de Immunostep. La evaluación de la viabilidad celular se llevó a cabo mediante el ensayo de MTT (bromuro 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio). Por último la funcionalidad celular se midió mediante el estudio de las concentraciones de calcio citosólico ([Ca2+]c) en respuesta al secretagogo CCK-8 10-9 M, por fluorimetría usando la sonda Fura-2-acetoximetil ester, a menudo abreviada, como Fura-2AM; y la curva de secreción de amilasa a concentraciones crecientes de CCK-8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El análisis de los ácidos grasos de membrana, reveló un enriquecimiento concretamente en el ácido grasos que se le añadió al medio. Además, de un cambio en la composición lipídica en general. La proporción de ácidos grasos saturados (SFA) del grupo MO fue significativamente menor que en los grupos NM y Mn-3, al igual que la cantidad de ácidos grasos monoinsaturados (MUFAs) y los ácidos grasos poliinasturados n-6 (PUFAs n-6). A su vez, el grupo Mn-3 mostró una mayor cantidad de de ácidos grasos poliinsaturados n-3 (PUFAs n-3), que los grupos MO y NM (Figura 1). Figura 1. Porcentaje de ácidos grasos saturados (SFA), ácidos grasos monoinsatuadas (MUFAs), ácidos grasos poliinsaturados n-6 (PUFAs n-6) y ácidos grasos poliinaturados n-3 (PUFAs n-3), presentes en las membranas de las células AR42J diferenciadas con dexametasona (100 nM), con membranas no modifcadas (NM), modificad en oleico (MO) y modificadas en PUFAs n-3 (Mn-3). Modelo de pancreatitis en AR42J diferenciadas Respuesta inflamatoria. La ceruleina produce una activación del NF-kB, la cual se observa mediante una disminución significativa (P<0.05) de la concentración citosólica de IkB¿, y un aumento también significativo (P<0.05) de los niveles nucleares de p65, por lo que dicha activación parece estar mediada por una degradación del IkB¿. Estos resultados coinciden con los obtenidos en otros autores tanto en estudios in vivo, llevados a cabo en rata, como in vitro, en acinos pancreáticos de rata y células AR42J (Han et al., 2000; Chan et al., 2011; Yu et al., 2002). La activación de este factor de transcripción se traduce en una mayor secreción de IL-6 (P<0.05) en este tipo de células tratadas con ceruleina. Sin embargo esta respuesta inflamatoria desencadenada por la ceruleina desaparece cuando son pretratadas con HT y luego se le indujo el daño, probablemente debido al efecto antioxidante ejercido por el HT, que parece estar eliminando las especies reactivas de oxígeno (ERO) producidas por la ceruleina, lo que podría interferir en la activación del NF-kB, el cual se ha visto en AR42J no diferenciadas que es sensible al estado oxidativo (Yu et al., 2002). Apoptosis/Necrosis. El tratamiento con ceruleina 10-8 M (grupo Ce-8NM) y ceruleina 10-7 M (grupo Ce-7NM), efectúa una disminución en el número de células vivas, produciendo mayoritariamente muerte por apoptosis. Sin embargo, el pretratamiento con HT evita ese descenso en células vivas observado en los grupos Ce-8NM y Ce-7NM. MTT. Los grupos Ce-8NM y Ce-7NM muestran un menor viabilidad que NM, lo que indica un posible efecto citotóxico por parte de la ceruleina, lo que estaría relacionado con el aumento de muerte por apoptosis que muestran estos grupos. La ceruleina podría estar ejerciendo un efecto citotóxico a nivel de la mitocondria y podría desencadenar la cascada apoptótica mediada por la liberación del citocromo c. Funcionalidad celular. El tratamiento con ceruleina produce una alteración en la respuesta a CCK-8, tanto en la tanto en [Ca2+]c (figura 2 A), como en la secreción de amilasa. Este alteración se mejoró cuando las células se pretrataron con HT antes y durante el daño con la ceruleina. A la vista de los resultados, nuestro modelo de pancreatitis aguda inducida por ceruleina en células AR42J diferenciadas es un buen modelo, ya que los hechos que hemos observado son similares a los acontecimientos descritos por otros autores, tanto en rata como en este modelo celular, con la diferencia de que al diferenciar obtenemos un fenotipo más semejante a la célula acinar pancreática de rata. Modelo de pancreatitis aguda en AR42J diferenciadas con membranas modificadas en oleico (MO) Respuesta inflamatoria. La ceruleina, a diferencia de las AR42J diferenciadas con membranas sin modificar, no produce una respuesta inflamatoria. De modo que no existen diferencias significativas ni en la activación de NF-kB, ni en la producción de ningunas de las citocinas inflamatorias analizadas, entre los grupos MO y CeMO. Esto nos sugiere una cierta protección antiinflamatoria por parte de este perfil lipídico de membrana, ante la exposición a un agente nocivo como es la ceruleina. Probablemente, por presentar un menor contenido en ácidos grasos poliinsaturados, lo que le confiere a la membrana una menor susceptibilidad a ser oxidada, afectando a su vez a la activación del NFkB. Apoptosis/necrosis. Los grupos Ce-8MO y Ce-7MO presente porcentajes similares de células vivas respecto a MO. Dentro del porcentaje restante, el grupo Ce-7MO presenta un ligero aumento en la apoptosis respecto a MO. El grupo de células AR42J diferenciadas cuyas membranas están modificadas en oleico muestra una gran estabilidad frente al daño con ceruleina. MTT. Solo a la dosis de ceruleina 10-7 M se observó un daño citotóxico respecto al grupo MO (P<0.05), pudiéndose relacionar con el aumento de muerte por apoptosis que presentó este grupo. Funcionalidad. En general, la respuesta a secretagogo, al igual que en las células NM, se encuentra dañada tras el tratamiento con ceruleina, tanto la movilización de calcio citosólico como la secreción de amilasa. Por lo que se puede ver, el perfil lipídico enriquecido en oleico podría estar ejerciendo un efecto protector antiinflamatorio ante la ceruleina en estas células. Sin embargo, al igual que en las células con membranas NM, la ceruleina altera la respuesta funcional inducida por CKK-8. Al igual que otros autores, hemos observado, en este tipo de membranas, un comportamiento ambiguo del HT, actuando como un posible pro/antioxidante (Gill et al., 2005; Perona et al., 2006). Modelo de pancreatitis aguda en AR42J diferenciadas con membranas modificadas en PUFAs n-3 (Mn-3) Respuesta inflamatoria. En células AR42J diferenciadas y con membranas ricas en PUFAs n-3, no se observa ni una activación del NFkB, ni diferencias significativas en la producción de citocinas inflamatorias, entre las tratadas y no tratadas con ceruleina. Este efecto antiinflamatorio de los PUFAs se ha descrito por otros autores en otros tipos de células, y parece estar mediado por la inhibición de la activación del NF-kB (Draper et al., 2010). Apoptosis/Necrosis. Solamente la dosis de ceruleina 10-7 M fue capaz de disminuir la cantidad de células vivas, provocando la muerte por apoptosis. Este efecto dañino no se observó cuando se trataron previamente y durante con HT. MTT. Ambas dosis de ceruleina produjeron una daño citotóxico, el cual desapareció con la presencia de HT. Funcionalidad. Se observa una disminución en la salida de Ca2+ desde los almacenes intracelulares en respuesta a CCK-8 cuando son tratadas con ceruleina. Sin embargo, en el caso de la secreción de amilasa, parece ser que el hecho de la modificación del perfil lipídico per se, produce una significativa disminución en la curva respecto a las células controles, y al añadir cerulina no disminuye mucho más. Sin embargo, cuando se tratan previamente con HT, la curva de secreción de amilasa se acerca a los valores presentados en las NM. Tanto las células enriquecidas en oleico como en PUFAsn-3 muestran una protección antiinflamatoria frente al daño producido por la ceruleina, probablemente por mecanismo diferentes. Aunque ninguno de los perfiles de membrana parece proteger el daño funcional que efectúa la ceruleina, si bien las Mn-3 ejercen un daño per se en la secreción de amilasa el cual no se observa cuando se tratan con HT. Esto sugiere que un alto contenido en AGPI en la membrana ejerce un efecto negativo en la funcionalidad celular. Este daño podría deberse a que una mayor cantidad de dobles enlaces confieren una mayor susceptibilidad a la membrana de sufrir peroxidación lipídica, y desencadenar un daño oxidativo per se, puesto que al tratarlas previamente con un antioxidante este disfunción desaparece. 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