Estudio de la modulación de la función biológica y actividad de la nadph oxidasa en macrófagos por la molécula de la familia de moléculas de activación de señalización de linfocitos (slamf) 8

Resumen

SLAMF8 es uno de los miembros de la familia del SLAM descrito más recientemente. Este grupo de moléculas participa en la respuesta inmunitaria innata y específica desempeñando diversas funciones en las células en las cuales se expresa. Así, estas moléculas actúan como correceptores en la transmisión de la señal intracelular en células T y NK, modulan distintos mecanismos celulares, son receptores de microorganismos patógenos e incluso recientes estudios atribuyen un papel en la diferenciación en el linaje hematopoyético. El trabajo presentado analiza el papel que desempeña SLAMF8 en el macrófago (Mg) durante la activación del fagocito, y en concreto, el efecto que tiene la falta de SLAMF8 sobre la actividad de la NADPH oxidasa. Además, se investigan los mecanismos moleculares por los que SLAMF8 regula tal efecto, identificando las principales vías que se ven involucradas en dicha modulación. Un análisis in vitro de la actividad de la NADPH oxidasa en Mg peritoneales de ratón obtenidos con TGC, mostró un aumento en la producción de ión superóxido en los Mg de ratones SLAMF8-/- respecto a los salvajes (WT) en respuesta a PMA y bacteria (E. coli o S. aureus). Por otro lado, mediante microscopía confocal se pudo observar que el reclutamiento de las subunidades p47phox y p22phox, componente citosólico y de membrana respectivamente de la NADPH oxidasa, ocurría más rápidamente a tiempos cortos tras la estimulación del Mg con PMA y E. coli. Este dato situó el reclutamiento de p47phox a la membrana del fagosoma antes que la fusión de las vesículas al fagosoma (determinado por p22phox) que se produce previamente a la activación de la NADPH oxidasa. Estos resultados sugieren que el aumento en la fusión de vesículas que contienen NADPH oxidasa en los Mg SLAMF8-/- estimulados con PMA o E. coli contribuiría a una activación más efectiva de la NADPH oxidasa y por tanto a una mayor producción de superóxido. Dado que el proceso de fosforilación y ensamblaje de las subunidades de la NADPH oxidasa son clave para la activación de este complejo, y este mecanismo parece estar regulado por diferentes quinasas, entre las destacan la proteína quinasa C (PKC), fosfoinositol 3-quinasa (PI3K) y p38 MAP quinasa, se analizó la fosforilación de p40phox y p47phox. Con el uso de un anticuerpo desarrollado frente a motivos de serina fosforilados por la PKC, se pudo determinar una mayor fosforilación de ambas subunidades en los Mg peritoneales SLAMF8-/- al ser comparados con los Mg WT tras ser estimulados con PMA, LPS y bacteria. Las activaciones con LPS y bacteria resultaron ser más leves sugiriendo un papel de la PKC menos importante en la activación de la NADPH oxidasa con estos estímulos. Este efecto fue reproducible en Mg derivados de médula ósea estimulados con PMA. Para estudiar si la ruta de la p38 MAPK estaba modificada en los Mg peritoneales SLAMF8-/- se analizó, mediante Western blot, la cantidad de p38 MAPK fosforilada. Los macrófagos SLAMF8-/- mostraron más cantidad de p38 MAPK fosforilada en comparación con los Mg WT tras estimular con PMA. Esta mayor activación de la p38 MAPK, asociada a un incremento en la fosforilación, se confirmó tras estimular con LPS y bacteria, E. coli y S. aureus. RAC constituye otro punto de control en la regulación de la NADPH oxidasa. Al estudiar por Western blot la movilización de RAC desde el citoplasma hacia la membrana, ésta resultó ser más rápida y de mayor intensidad en los Mg peritoneales SLAMF8-/- en comparación con los Mg procedentes de ratones WT. Para confirmar si el papel regulador sobre la NADPH oxidasa de SLAMF8 se producía también en humano, se estudió, por Western blot, la activación de la NADPH oxidasa a través de la subunidad citosólica p47phox fosforilada vía PKC en monocitos (Mo) humanos de sangre periférica estimulados con PMA e incubados previamente con IFN gamma. La fosforilación de esta subunidad fue mayor cuando se aumenta la expresión de SLAMF8 inducida por el IFN gamma, confirmando los resultados observados en Mg peritoneales de ratón en los que la ausencia de SLAMF8 conllevaba un aumento en la fosforilación de p47phox y p40phox. Estos datos sugieren que SLAMF8 ejerce también un papel regulador en Mo humanos de sangre periférica, al igual que ocurre en los Mg peritoneales de ratón. Por otro lado, al examinar la actividad de la quinasa p38 MAPK en los Mo humanos de sangre periférica por Western blot, pudimos comprobar que estos Mo estimulados con PMA, previamente tratados con IFN gamma, muestran una mayor fosforilación de la p38 MAPK respecto a los Mo sin tratar con IFN gamma. En conclusión, SLAMF8 parece tener una función reguladora sobre la NADPH oxidasa en los Mo humanos de sangre periférica equivalente a la observada por este grupo en los M¿ peritoneales de ratón. Dado los resultados obtenidos por nuestro grupo en los Mg peritoneales SLAMF8-/-, los cuales presentan una mayor activación de la NADPH oxidasa y como resultado una mayor producción de superóxido, y puesto que la producción de ROS es esencial para una eliminación eficiente de bacteria, se estudió si los ratones deficientes en SLAMF8 presentaban la capacidad microbicida alterada en comparación con los ratones WT. Al analizar la actividad bactericida de los ratones BALB/c SLAMF8-/- en un ensayo basado en la supervivencia de una cepa atenuada de Salmonella en el ratón, obtuvimos que la capacidad microbicida del ratón deficiente en SLAMF8 resultó ser más eficiente frente a Salmonella que los ratones WT. Estos resultados son coherentes con el hecho de que los Mg SLAMF8-/- tienen aumentada la actividad NADPH oxidasa. Además, ensayos in vitro, demostraron que los Mg peritoneales SLAMF8-/- no presentaban alterada la actividad fagocítica, mostrando la misma capacidad de fagocitosis de E. coli y S. aureus que los Mg WT. Estos datos confirman que SLAMF8 actúa como regulador negativo de la NADPH oxidasa modulando las principales vías de regulación de dicha enzima: PKC, p38 MAPK y RAC. Por otra parte, SLAMF8 podría estar participando en la fusión de vesículas que contienen NADPH oxidasa, contribuyendo a una activación más efectiva de la NADPH oxidasa y por tanto a una mayor producción de superóxido.