Versatility in rhizobial respiration under oxygen-limiting conditionsnew insights in the denitrification regulatory network

Resumen

Las bacterias del suelo conocidas con el nombre genérico de rizobios son capaces de fijar el dinitrógeno atmosférico en asociación simbiótica con plantas leguminosas. Esta asociación es de gran interés agrícola y medioambiental, debido a la capacidad de la bacteria de proporcionar a la planta el nitrógeno necesario para su nutrición y desarrollo, reduciendo las necesidades de fertilización química. Por ello, el uso de inoculantes microbianos para mejorar la nutrición de los cultivos constituye una tecnología de gran interés por su impacto positivo sobre la sustentabilidad agrícola y su carácter respetuoso con el medio ambiente. Además de fijar nitrógeno, algunas especies de rizobios son capaces de desnitrificar tanto en vida libre como en simbiosis. La desnitrificación es un proceso clave en el ciclo biogeoquímico del N en la biosfera, ya que es el mecanismo mediante el cual se devuelve a la atmósfera el N2 fijado. Este proceso es el mecanismo principal para eliminar el exceso de nitratos que, como consecuencia del abuso en la utilización de fertilizantes nitrogenados en la agricultura, contaminan los ecosistemas terrestres y acuáticos. La contaminación de acuíferos por nitratos y nitritos es un grave problema con repercusiones en la salud pública. Además, el óxido nítrico y el óxido nitroso, productos intermediarios de la desnitrificación, tienen también un enorme impacto sobre la contaminación atmosférica, ya que son gases que se liberan a la atmósfera e intervienen en la formación de la lluvia ácida, en el calentamiento global de la atmósfera, y en la destrucción de la capa de ozono. La desnitrificación tiene, por tanto, un gran impacto en la agricultura, medioambiente y salud humana. La desnitrificación es una forma alternativa de respiración por la que, en condiciones limitantes de oxígeno, los microorganismos pueden utilizar el nitrato y sus óxidos de nitrógeno derivados (NOx) como aceptores de electrones en una cadena de transporte hasta la formación de N2. La reducción de los NOx está acoplada a la producción de ATP, lo que permite a la célula crecer en condiciones limitantes de oxígeno. La desnitrificación consiste en la completa reducción del nitrato (NO3-) o nitrito (NO2-) hasta nitrógeno molecular (N2), a través de la producción de los intermediarios óxido nítrico (NO) y óxido nitroso (N2O). Estas reacciones tienen lugar secuencialmente por la actuación de las enzimas nitrato reductasa (Nap/Nar), nitrito reductasa (CuNir/cd1Nir), óxido nítrico reductasa (qNor/cNor) y óxido nitroso reductasa (Nos), codificadas por los genes nap/nar, nirK/nirS, cnor/qnor y nos, respectivamente (Zumft et al., 1997; van Spanning et al., 2005, 2007; Kraft et al., 2011; Richardson, 2011; Bueno et al., 2012). Bradyrhizobium japonicum es el único rizobio en el que se han aislado y caracterizado los genes de la desnitrificación napEDABC (Delgado et al., 2003), nirK (Velasco et al., 2001), norCBQD (Mesa et al., 2002) y nosRZDFYLX (Velasco et al., 2004), implicados en la síntesis de las enzimas nitrato reductasa periplásmica (Nap), nitrito reductasa (NirK), óxido nítrico reductasa (cNor) y óxido nitroso reductasa (Nos), respectivamente (revisado por Potter et al., 2001; Richardson et al., 2001; Zumft, 2005; González et al., 2006; Richardson et al., 2007; de Vries et al., 2007; Richardson, 2011; van Spanning, 2011; Spiro, 2012). Como en muchos otros desnitrificantes, la expresión de los genes de la desnitrificación, en B. japonicum, ocurre en condiciones limitantes de oxígeno y presencia de nitrato, o un NOx derivado de él (revisado por Bedmar et al., 2005; Delgado et al., 2007). En B. japonicum existe una sofisticada red de regulación formada por dos cascadas que coordinan la expresión genes implicados en la respiración microóxica (cascada FixLJ/FixK2) y en la fijación de nitrógeno (cascada RegSR/NifA) (Sciotti et al., 2003). El papel de la cascada FixLJ/FixK2 está bien establecido, la cual en condiciones microóxicas (¿ 5% O2 en la fase gaseosa), induce la expresión, entre otros, de los genes fixNOQP, responsables de la síntesis de la oxidasa terminal cbb3 de alta afinidad por oxígeno (Nellen-Anthamatten, 1998). En dichas condiciones, FixK2 controla también la expresión de los genes nap y nirK, pero no la de los genes nor (Mesa et al., 2008). Además, mediante el empleo de ensayos de transcripción in vitro (Mesa et al., 2005), hemos podido demostrar que FixK2, en colaboración con la ARN polimerasa de B. japonicum activa la transcripción de los genes nap y nirK, pero no la de los genes nor (Bueno et al., enviado para su publicación). En B. japonicum, se ha identificado el gen nnrR, que codifica la proteína NnrR (nitrite and nitric oxide reductase regulator), homóloga a otros reguladores transcripcionales de la familia CR/FNR (Mesa et al., 2003). La activación microaeróbica de nnrR está controlada por FixK2 (Mesa et al., 2003; Mesa et al., 2008). Recientemente, hemos sido capaces de demostrar, en ensayos de calorimetría en ausencia de oxígeno, que la proteína NnrR se une al promotor de los genes nor , pero no al de los genes nirK y napE (Robles et al., enviado para publicación). Por lo tanto, mientras que NnrR ejerce un control directo sobre los genes nor, el control sobre los genes nirK y napE es más bien indirecto (Robles et al., enviado para publicación). La cascada RegSR/NifA principalmente induce la expresión de los genes necesarios para la fijación de nitrógeno en respuesta a concentraciones muy bajas de O2 (¿ 0,5% en la fase gaseosa). Recientemente, se ha demostrado que la proteína NifA, además, es necesaria para la máxima expresión de los genes de la desnitrificación en B. japonicum (Bueno et al., 2010). En base a estos resultados, nos planteamos investigar si la cascada RegSR también pudiera estar implicada en la regulación de los genes de la desnitrificación. RegSR pertenece a la familia de sistemas reguladores de dos componentes presentes en un amplio número de proteobacterias y que principalmente ejercen un control en respuesta a cambios en el potencial redox, donde RegS es la proteína que percibe la señal y RegR la proteína reguladora (revisado por Bueno et al., 2012). Para ello, llevamos a cabo un análisis comparativo del transcriptoma de la cepa parental y de una mutante regR, ambas crecidas en condiciones anóxicas con nitrato como aceptor final de electrones y con succinato como fuente de carbono. Los resultados obtenidos revelaron que más de 600 genes inducidos en condiciones desnitrificantes, están también regulados por RegR. Estos datos indican que RegR es un regulador global y de gran importancia en estas condiciones de cultivo. Entre los genes identificados se encuentran los genes nor y nos, genes que codifican la Nor y Nos, respectivamente. También se identificaron como dianas de RegR otros genes implicados indirectamente en la desnitrificación como son los genes cycA y c2, que codifican transportadores de electrones. Además de genes relacionados con desnitrificación, también se identificaron otros implicados en detoxificación de óxido nítrico (blr2806-09), así como genes reguladores (bll3466, bll4130). Mediante diferentes aproximaciones experimentales que explicaremos en detalle más adelante, hemos podido demostrar en esta Tesis Doctoral, que tanto la anoxia como el nitrato están implicados en la inducción de los genes nor por la proteína RegR y que dicho control es independiente de su proteína sensora RegS. Este nuevo nivel en el control de los genes de la desnitrificación en B. japonicum está en concordancia con las evidencias que nos indican la existencia de un exhaustivo control de la expresión génica en respuesta a condiciones adversas como son la limitación de O2. Otra proteína clave a este respecto, que permite a la bacteria tanto crecer en vida libre en condiciones limitantes de oxígeno, así como capacitarla para obtener energía en el ambiente microóxico que existe en el nódulo simbiótico, es la oxidasa terminal cbb3 de alta afinidad por el oxígeno, codificada por el operón fixNOQP. Esta proteína ha sido ampliamente estudiada en B. japonicum (Preisig et al., 1993, 1996). En cambio, su caracterización es más limitada en Ensifer meliloti, que a diferencia de B. japonicum, tiene tres copias de los genes fixNOQP. De estas tres copias que están localizadas en el megaplásmido pSymA (Galibert et al., 2001), las copias 1 y 2 son muy parecidas entre sí. La copia 1 se localiza en un entorno genético donde se encuentran una serie de genes reguladores como fixLJ, fixT1, fixK1, fixM, convirtiendo a esta copia como la candidata potencial para ser la copia funcional de la oxidasa terminal cbb3 en E. meliloti. La copia 3 se ha relacionado con el metabolismo del fósforo (Krol and Becker, 2004). En el transcurso de esta Tesis, hemos realizado un análisis fenotípico de la mutante fixN1 de E. meliloti tanto en vida libre como en simbiosis. En vida libre, pudimos observar un defecto en crecimiento en una mutante fixN1 con respecto a la cepa parental crecidas en medio mínimo tanto en condiciones aeróbicas como microaeróbicas, al igual que se observó una disminución de la actividad oxidasa dependiente de N,N,N¿,N¿,-tetrametil-p-fenilenediamina (TMPD). En condiciones simbióticas, las plantas inoculadas con la cepa mutante en fixN1 mostraron una clara deficiencia en la fijación de nitrógeno tras 3 semanas de crecimiento con una solución nutritiva libre de nitrógeno. Este fenómeno no se observó cuando las plantas se crecieron hasta 8 semanas, indicando que la copia 1 de la fixNOQP no es necesaria para la fijación de nitrógeno en períodos de cultivo más prolongados. Aunque, nuestros resultados no confirmaron que la copia 2 es la que se activa en dichas condiciones de crecimiento, sí nos permitieron concluir que ambas copias no tienen funciones redundantes, siendo la copia fixNOQP1 de E. meliloti crucial para la fijación de nitrógeno en las etapas iniciales de la fijación de nitrógeno (Torres et al., 2013). Gracias a estos estudios, se ha podido identificar por primera vez que los citocromos c de membrana de 27 y 32 KDa se corresponden, respectivamente, con las subunidades FixO y FixP de la oxidasa terminal cbb3 de E. meliloti (Torres et al., 2013). E. meliloti también posee los genes nap, nir, nor y nos responsables de la desnitrificación localizados en el genoma del megaplásmido simbiótico pSymA. Además, estudios de transcriptómica habían demostrado previamente la inducción de estos genes en condiciones microóxicas (Becker et al., 2004) y que E. meliloti poseía actividad desnitrificante tanto en vida libre como en simbiosis (Garcia-Plazaola et al., 1993; 1996). Sin embargo, hasta el inicio de este trabajo, E. meliloti solo había sido considerado como un desnitrificante parcial debido a su incapacidad para crecer en condiciones limitantes de oxígeno a expensas del nitrato o del nitrito como aceptores finales de electrones. Durante el desarrollo de esta Tesis, hemos podido demostrar que E. meliloti es capaz de usar el nitrato o el nitrito como sustratos respiratorios en condiciones microóxicas, indicando que, a diferencia de B. japonicum, que es capaz de desnitrificar en condiciones anóxicas, la desnitrificación en E. meliloti requiere la presencia de bajas tensiones de oxígeno (Torres et al., 2011). Para completar estos estudios, hemos llevado a cabo una caracterización funcional de los genes nap, nirK, nor y nos de E. meliloti, demostrando la implicación de estos genes en la capacidad de usar nitrato como sustrato respiratorio en condiciones microóxicas por esta bacteria. Gracias a la técnica de tinción de grupos hemo, hemos podido identificar que el citocromo tipo c de membrana de 16 kDa se corresponde con la proteína NorC, componente de la óxido nítrico reductasa. Además, las actividades NR y Nir y la actividad Nor, disminuyeron significativamente en las mutantes napA, nirK y norC, respectivamente. Así mismo, una mutante nosZ, acumuló N2O en el medio de cultivo cuando se incubó en condiciones microóxicas con nitrato. En su conjunto, estos resultados muestran claramente la implicación de los genes de la desnitrificación de E. meliloti tanto en la respiración de nitrato y como en el proceso de desnitrificación en condiciones microóxicas. Por último cabe mencionar que los genes napA, nirK, norC y nosZ de E. meliloti, también se expresaron en condiciones de anoxia en presencia de nitrato (donde se alcanzan sus valores máximos de expresión). Además las enzimas Nap, Nir y Nor son activas en dichas condiciones. Por tanto, la incapacidad de E. meliloti de crecer anaeróbicamente con nitrato no se debe ni a un defecto en la expresión de los genes de la desnitrificación, ni a la ausencia de actividad de las enzimas desnitrificantes. Posibles hipótesis para explicar esta observación se estudiarán en profundidad en experimentos futuros.