Producción de biodiesel a partir de lípidos de la microalga nannochloropsis gaditana mediante reacciones de transesterificación enzimáticas ( biodiesel production from nannochloropsis gaditana lipids through enzymatic transesterification)

Resumen

Esta tesis forma parte de la investigación que se lleva a cabo en el Área de Ingeniería Química de la Universidad de Almería, y que tiene como objetivo la producción de ésteres metílicos (EM, biodiesel) a partir de los lípidos de la microalga Nannochloropsis gaditana mediante reacciones de transesterificación enzimática. Debido al agotamiento de las reservas de petróleo y al aumento de la preocupación por el cambio climático, existe en los últimos años un creciente interés por la búsqueda de fuentes de energía alternativas. En este sentido, la producción de biodiesel a partir de microalgas parece ser una alternativa prometedora. El principal objetivo de este trabajo es estudiar la producción de ésteres metílicos (EM, biodiesel) a partir de los lípidos extraídos de la biomasa húmeda de la microalga Nannochloropsis gaditana mediante reacciones de transesterificación enzimática, utilizando tanto lipasas extracelulares como intracelulares, inmovilizadas en diferentes soportes o en dispersión en el medio de reacción. Se analizan la transesterificación de los lípidos saponificables (LS) previamente extraídos de la biomasa húmeda y la transesterificación directa de estos lípidos contenidos en la biomasa microalgal. Por otra parte, se ha estudiado la estabilidad de las lipasas utilizadas como catalizadores y la mejora en su reutilización a través de la modificación de la composición de los lípidos del extracto, usando varios métodos de extracción de los lípidos saponificables (LS) de la biomasa microalgal. También se estudia la influencia del contenido en lípidos polares del extracto (glucolípidos y fosfolípidos) en la velocidad de reacción, conversión a EM y estabilidad de la lipasa al usarla para catalizar varios ciclos de reacción. En los capítulos 3 a 6 se acometen estos objetivos mediante el desarrollo de las siguientes tareas: 1) Optimización de un método de extracción de los LS de la biomasa húmeda de N. gaditana. 2) Realización de experimentos para seleccionar la lipasa extracelular más adecuada para catalizar la transesterificación de los LS microalgales con el fin de obtener las máximas conversiones a EM y las mayores velocidades de reacción. 3) Optimización del proceso de producción de biodiesel mediante transesterificación catalizada por la lipasa extracelular previamente seleccionada. 4) Cultivo del hongo Rhizopus oryzae, que contiene una lipasa intracelular, para su utilización como catalizador en la producción de biodiesel. 5) Optimización del proceso de producción de biodiesel mediante transesterificación catalizada por la lipasa intracelular de R. oryzae 6) Optimización de la producción de biodiesel mediante transesterificación directa de los LS contenidos en la biomasa húmeda de N. gaditana, catalizada por la lipasa extracelular seleccionada en el punto 2. 7) Realización de ensayos para determinar un método de extracción de LS adecuado para reducir el contenido en lípidos polares del extracto y estudiar la influencia que ejercen estos lípidos polares en la velocidad de reacción, conversión a EM y en la reutilización de las lipasas en varios ciclos de reacción. En la primera etapa de este trabajo, descrita en el capítulo 3, los LS contenidos en la biomasa húmeda de la microalga N. gaditana fueron extraídos con etanol y parcialmente purificados con hexano. En estas condiciones, se extrajeron el 85% de los LS contenidos inicialmente en la biomasa microalgal y se obtuvo un extracto con un 31% en LS. Este bajo contenido en LS se aumentó hasta el 95% mediante cristalización en acetona a baja temperatura. Para llevar a cabo la transesterificación de los LS de este extracto se probaron en primer lugar cuatro lipasas extracelulares, con el fin de seleccionar la que ofreciera la máxima velocidad de reacción y conversión a EM. Así, se seleccionó la lipasa Novozym 435 de Candida antarctica (N435) para llevar a cabo la optimización del proceso. En las condiciones determinadas como óptimas en la tarea 3 (10 mL t-butanol/g LS, relación molar metanol/LS 11:1, 0,225 g N435/g LS, 48 h, 200 rpm y 40 ºC) se consiguió una máxima conversión a EM del 94,7%. Además se observó que en estas condiciones la conversión alcanzada descendía un 9,8% cuando la misma lipasa era utilizada para catalizar tres ciclos de reacción consecutivos (Capítulo 3). Debido al elevado coste de las lipasas extracelulares, como N435, se llevó a cabo el cultivo del hongo Rhizopus oryzae con el fin de utilizarlo como catalizador. La utilización de todo el hongo como catalizador reduce de forma considerable el coste del proceso al eliminar las etapas de purificación e inmovilización de la enzima (tarea 4). Utilizando este catalizador se obtuvieron las siguientes condiciones óptimas para la transesterificación de los LS extraídos de la microalga: 10 mL t-butanol/g LS, relación molar metanol/LS 11:1, 0,7 g R. oryzae/g LS, 72 h, 35 ºC y 130 rpm. En estas condiciones el 83% de los LS contenidos en el extracto fueron convertidos a EM (tarea 5). Además, se llevó a cabo un estudio de la estabilidad de la lipasa utilizándola en tres ciclos de reacción consecutivos y se observó que la composición en lípidos del extracto (especialmente el contenido en lípidos polares) ejercía una fuerte influencia en las velocidades de reacción, en la conversión a EM y en la reutilización de la lipasa en varios ciclos. En este sentido, y para poder demostrar la influencia de los lípidos polares en la estabilidad de la lipasa, se obtuvo un nuevo extracto lipídico con menor contenido en lípidos polares mediante la extracción de los LS de la microalga con hexano (contenido en lípidos polares del extracto del 37,4 % en lugar del 49 % que contiene el extracto obtenido con etanol-hexano). Utilizando sólo hexano el rendimiento de extracción de LS fue menor pero el extracto tenía mayor pureza en LS (57% y 56%, respectivamente) que el obtenido utilizando etanol-hexano (85% y 31%, respectivamente). El contenido en LS del extracto obtenido con hexano (56%) se aumentó hasta el 61% mediante cristalización en acetona. Utilizando este extracto para obtener biodiesel la conversión a EM descendió del 83 al 71% después de reutilizar la enzima en tres ciclos de reacción de 72 h cada uno, pero este descenso de la conversión (14%) fue menor que el obtenido utilizando los lípidos extraídos con etanol-hexano, que presentaban un mayor contenido en lípidos polares (con éstos el descenso de la conversión fue del 81 al 34%, es decir, un descenso del 58%). Estos resultados podrían indicar que la estabilidad de la lipasa es mayor cuanto menor es el contenido en lípidos polares del extracto de LS (tarea 5, capítulo 4). A continuación, para evitar la etapa de extracción de los LS, se realizaron experimentos para optimizar un proceso de producción de biodiesel por transesterificación directa de los LS en la biomasa (tarea 6, capítulo 5). En este caso, en primer lugar se realizó un estudio para determinar si el pretratamiento de la biomasa húmeda de N. gaditana mediante homogenización a alta presión (HPH, de sus siglas en inglés) ofrecía alguna ventaja con respecto a la biomasa sin pretratar. Se determinó que esta homogenización previa era necesaria, ya que facilitaba la rotura de las células microalgales, aumentando así el acceso del disolvente (t-butanol) y del reactivo (metanol) a los LS que se encuentran en el interior de la célula y, por tanto, se aumentaba la conversión a EM y la extracción in situ de éstos desde el interior de las células. Así, en las condiciones determinadas como óptimas en este trabajo (7,1 mL t-butanol/g aceite, 4,6 mL metanol/g aceite, 0,319 g N435/g aceite, 40ºC y 56 h) se obtuvo una conversión máxima a EM del 99,5%. Por otra parte, y tal y como se esperaba, debido al alto contenido en lípidos polares de la biomasa de partida, la conversión descendió hasta un 40% cuando el mismo lote de lipasa fue utilizado para catalizar tres ciclos de reacción consecutivos (tarea 6, capítulo 5). Finalmente, en el capítulo 6, para confirmar algunos de los resultados obtenidos hasta el momento, se aplicaron siete métodos de extracción de LS con el fin de obtener fracciones de LS con distinto contenido en lípidos polares. Además, el contenido en lípidos polares de algunas fracciones se redujo mediante cristalización en acetona a baja temperatura. Se observó que el contenido en lípidos polares de las fracciones obtenidas depende principalmente de la polaridad (log P) del disolvente empleado en primer lugar en cada sistema extractante (etanol, hexano, isopropanol o acetato de etilo). Así, se obtuvieron diferentes extractos con contenidos en lípidos polares comprendidos entre el 75 y el 15,3%. Algunos de estos extractos de LS fueron transformados a EM mediante reacciones de transesterificación catalizadas con las lipasas N435 y R. oryzae, con el fin de determinar la influencia que ejerce el contenido en lípidos polares en las conversiones alcanzadas y en la reutilización de la lipasa, utilizando t-butanol como medio de reacción. Se observó que las velocidades de reacción y la conversión a EM alcanzadas eran mayores cuanto menor era el contenido en lípidos polares del extracto utilizado. Además, el descenso de la conversión a EM utilizando el mismo lote de lipasa en varios ciclos de reacción consecutivos era también mayor con los extractos de mayor contenido en lípidos polares, debido a la desactivación de las lipasas en presencia de los lípidos polares y del metanol, incluso empleando t-butanol como medio de reacción. Estos resultados ponen de manifiesto la importancia de utilizar LS con el menor contenido posible en lípidos polares para la producción de biodiesel, a pesar de que estos lípidos polares también son convertibles a EM.