Design, synthesis and biological evaluation of 6-alkoxypurine derivatives as kinase inhibitors

Resum

Deregulation of protein kinases activity has emerged as a key mechanism by which cancer cells acquire the ability to escape normal physiological constraints on growth and survival. From the vast efforts made by the industry and academia on the development of molecules able to inhibit these proteins, many common structural elements present in kinase inhibitors have emerged, among which the purine ring system play a dominant role. In this thesis I present the development of different families of 6-alkoxypurine derivatives guided by a phenotypic approach by the use of a panel of 6 cancer cell lines. Thus, it is shown the exploration process of 6-alkoxypurine DAPK1 inhibitors and the design and synthesis of the first 9-N,N-dialkylamino or 9-(1-azacycloalkan-1-yl) substituted purines to replace the typical alkyl groups presented at this position in many purine-based kinase inhibitors. This modification together with the implementation of a CuAAC diversification strategy at the C6 position generated a large compound library with molecules that exhibited two types of activities: apoptotic induction and G2/M arrest. Furthermore, these new purine scaffolds showed great improvements in their physicochemical properties compared to previous compound libraries and optimization efforts made over the most active compounds showed that the 9-N,N-dialkylamino or 9-(1-azacycloalkan-1-yl) substituted purines lead to more selective activity profiles compared with the classic 9-alkylated analogs. El cáncer es la segunda causa de muerte en el mundo, solo superada por las enfermedades cardiovasculares. A pesar de que se ha avanzado mucho en su prevención, diagnóstico y tratamiento, el número de casos sigue aumentando de forma alarmante año tras año. Es por ello que tanto la industria farmacéutica como centros de investigación de todo el mundo están centrando sus esfuerzos en el estudio de los mecanismos moleculares que están detrás de esta enfermedad, con el objetivo de encontrar nuevas estrategias para su tratamiento. Producto de ello, las proteínas cinasas han surgido como prometedoras dianas moleculares para tratar la enfermedad. Estas proteínas pertenecen a una familia constituida por más de 500 enzimas que intervienen en multitud de procesos y actúan como reguladores de la actividad celular. Alteraciones en su función y expresión producen una pérdida de control en la homeostasis celular que lleva finalmente a la aparición de procesos cancerosos además de otras enfermedades. De esta manera, la sobreexpresión o hiperactividad de ciertas proteínas cinasas se ha descrito como un factor determinante en el desarrollo de muchos tipos de cánceres como leucemias, cáncer de mama, cáncer de colon, etc. Todo ello, junto con el surgimiento de las llamadas terapias dirigidas, ha permitido el desarrollo de inhibidores selectivos de estas proteínas, dando lugar al descubrimiento de moléculas como el Imatinib que han supuesto un cambio de paradigma en el pronóstico de enfermedades como las leucemias, en las que hasta ahora su tratamiento estaba limitado a tratamientos de quimioterapia muy agresivos con bajas tasas de supervivencia asociadas. Sin embargo, a pesar de los éxitos obtenidos con estas nuevas terapias, el desarrollo de inhibidores selectivos de proteínas cinasas es un campo que presenta ciertas limitaciones, principalmente debido a la gran similitud estructural que presentan las proteínas de esta familia. Este hecho hace que la inhibición selectiva de la o las cinasas diana sea una tarea especialmente complicada. En esta tesis se describe el desarrollo de pequeñas moléculas derivadas del anillo de 6-alcoxypurina como inhibidores de proteínas cinasas para el tratamiento de distintos tipos de cánceres. La progresión química de las diferentes familias de compuestos sintetizados ha sido guiada mediante cribados fenotípicos y ensayos de proliferación celular en un panel compuesto por 6 líneas de células cancerígenas (Jurkat, K563, HeLa, G361, MDA-MB-231 y HCT-116). El diseño inicial de estas moléculas se basó en las estructuras de inhibidores selectivos de DAPK1 previamente descritos por nuestro grupo que presentaron potentes actividades pro-apoptóticas en células tumorales. Inicialmente, sobre estos inhibidores se realizaron modificaciones en las posiciones 6, 8 y 9 del anillo de purina con el objetivo de generar moléculas con mejores actividades biológicas. Así, la introducción del grupo fenetilo en posición N9 dio lugar a compuestos inductores de apoptosis en células Jurkat que fueron 2 veces más potentes que los compuestos líderes de partida. Sin embargo, a pesar de la sustancial mejora en la actividad, los compuestos sintetizados presentaron elevados valores de lipofilia, lo que podría dificultar optimizaciones posteriores y su uso en ensayos in vivo. Debido a ello, se introdujo un novedoso cambio del grupo tert-butilo en posición N9 del compuesto líder por grupos N,N-dimetilamino y 1-azacicloalcan-1-ilo, que dieron lugar a compuestos estructuralmente muy parecidos pero con propiedades fisicoquímicas mejoradas. Con el objetivo de explorar esta nueva estructura purínica, se desarrolló una nueva metodología sintética que incluyó una estrategia de diversificación estructural basada en cicloadiciones alquino-azida catalizadas por cobre, que permite la generación de amplias familias de purinas y derivados sustituidos en posiciones 6, 8 o 9. Así, se sintetizó una familia de 35 compuestos que presentaron dos efectos fenotípicos diferentes: por un lado los compuestos sustituidos en posición C8 por fenilo indujeron apoptosis principalmente en células Jurkat; y por otro lado, se observó que uno de los compuestos sustituido en C8 por H presentó una potente actividad como bloqueador del ciclo celular en la fase G2/M en todas las líneas de células cancerígenas utilizadas. Buscando optimizar las actividades de ambas clases de compuestos se llevó a cabo la exploración de la posición N9, en la que se introdujeron diferentes grupos 1-azacycloalcan-1-ilo así como los clásicos grupos isopropilo y tert-butilo presentes en esta posición en multitud de inhibidores derivados de purinas. Pese a que ninguno de los derivados mantuvo el efecto de parada en G2/M, los ensayos realizados con los derivados generados de compuestos pro-apoptóticos mostraron un elevado grado de selectividad celular, que varió dependiendo del grupo 1-azacycloalcan-1-ilo presente en la estructura, por células Jurkat o K562. En contraposición, los compuestos que presentaron grupos isopropilo y tert-butilo, no mostraron ningún tipo de selectividad. Como resultado de este trabajo se generaron 64 derivados de 6-alcoxipurina mediante el uso de 4 rutas sintéticas diferentes. Se consiguió una mejora sustancial de la actividad pro-apoptótica del producto de partida y además, por primera vez en análogos purínicos se describen sustituciones de los grupos alquilo en posición N9 por N,N-dimetilamina y grupos 1-azacycloalcan-1-ilo, cuyos derivados presentan propiedades fisicoquímicas mejoradas y mayor selectividad celular.