Hiperoxaluria primaria tipo ienfermedad conformacional

Resumen

La hiperoxaluria es una enfermedad que se define como el aumento de concentración de oxalato en los fluidos biológicos (Osswald et al., 1979). Los depósitos de oxalato se manifiestan como urolitiasis, nefrocalcinosis, pielonefritis y en casos extremos como fallo renal seguido de una oxalosis sistémica. La enfermedad se clasifica en hiperoxaluria primaria, de origen genético, e hiperoxaluria secundaria, con origen ambiental. La hiperoxaluria primaria tipo I (HOP1) es una enfermedad de origen genético y hereditario con herencia autosómica recesiva con marcado carácter monogénico. Está causada por la deficiencia de la enzima alanina:glioxilato aminotransferasa (AGT) que es una proteína peroxisomal hepática cuyo cofactor es el piridoxal fosfato (PLP). Su función principal que es la detoxificación del glioxilato (Takada, 1984); cataliza la transaminación irreversible del glioxilato a glicina (Danpure, 2001; Barrat, 1999; Danpure, 1996). En pacientes de HOP1, la AGT es incapaz de convertir el glioxilato en glicina, este se acumula y sumado al producido por la DAO (D-aminoácido oxidasa) y la GO (glicolato oxidasa) se oxida hasta convertirse en oxalato. Se han encontrado muchas mutaciones responsables de causar la enfermedad. En general, para que tengan efecto, la mayoría de las mutaciones cosegregan con el alelo minor. Sin embargo, se han descubierto nuevas mutaciones que causan la enfermedad con independencia del haplotipo. Se define como haplotipo minor a los siguientes cambios: (i)exón1-C154T provocando el cambio Pro11Leu, (ii)exón 2-C386T originando un cambio sinónimo, (iii)exón 10- A1142G conducente al cambio Ile340Met se conocen haplotipos recombinantes), (iv) duplicación de 74 pb en el intrón 1 y la aparición de un VNTR del virus Epstein-Barr en el cuarto intrón. El objetivo general del presente trabajo pivota en torno a la hipótesis que la mayoría de los casos de HOP1, debidos a mutaciones del gen AGXT, son ejemplos de enfermedad conformacional. En este grupo de enfermedades, cambios en la secuencia de aminoácidos consecuencia podrían conllevar modificaciones en la estructura tridimensional de la proteína jugando un papel central en el desarrollo de la enfermedad. El conocimiento del efecto de estos cambios sentará la base de posibles estrategias terapéuticas, mutación-específicas, basadas en el uso de moléculas capaces de modificar el plegamiento proteico. Para avanzar en esta hipótesis, nos planteamos los siguientes objetivos concretos: a. Optimización de la expresión de AGT en E.coli. Una parte central en la caracterización físico-química de proteínas es el perfeccionamiento de los métodos de expresión, probando diferentes promotores, condiciones de inducción, solubilización, y purificación de la proteína recombinante. Especialmente, probaremos la hipótesis que la coexpresión de chaperones moleculares y la proteína AGT puede mejorar el rendimiento de los métodos de expresión. b. Definición de residuos importantes en los trastornos conformacionales en la proteína AGT. Utilizando como modelo la combinación polimorfismo-mutación más importante en nuestro medio (P11L + I244T), planteamos un rastreo de residuos relevantes en su déficit funcional mediante mutagénesis aleatoria y recuperación en un organismo modelo sencillo: E.coli. Este escrutinio es dependiente del desarrollo de un sistema de selección por auxotrofía, que será un objetivo concreto de esta tesis doctoral. c. Caracterización físico-química de la proteína AGT, variantes mutadas relevantes y mutaciones nuevas diagnosticadas en nuestro laboratorio. Idealmente, llevaremos la caracterización estructural de las variantes mutadas hasta la cristalización si es posible. Si no se lograran obtener cristales, concluiremos con la caracterización físico-química de AGT en solución. d. Caracterización estructural de la proteína GO. La cristalización de proteínas y su análisis por difracción de rayos X son elementos cruciales en el estudio de las consecuencias físico-químicas de las mutaciones y en la búsqueda de estrategias que mejoren el plegamiento funcional de las proteínas mutadas. Para aprender la metodología necesaria nos planteamos expresar y cristalizar la glicolato oxidasa de ratón. La elección de esta proteína se basa en que es una diana terapéutica potencial en la que queremos probar la acción de inhibidores de la producción de oxalato. El trabajo desarrollado abordó el estudio de la HOP1 desde muy diversos puntos de vista los resultados son una muestra heterogénea, aunque no dispar en lo que técnicas y modos de abordar el problema se refiere. Los resultados y las conclusiones que se deducen de ellos se pueden resumir como sigue: 1. La experimentación con sistemas de expresión proteica en bacterias nos condujo al uso de un sistema de inducción en frío (pColdII). Con él, la producción de AGT*LTM, responsable de HOP1 predominante en Canarias, aumentó pero mayoritariamente como proteína insoluble. 2. La solubilidad de las formas mutantes de AGT que conducen a la agregación, total o parcial, de la misma se ve mejora cuando estas son expresadas en presencia de del complejo GroE. Sin embargo, cuando es expresada en presencia de DnaJ/DnaK/GrpE o TF no se aprecia dicho efecto. El incremento de la solubilidad de la variante mutada se traduce en un aumento de la actividad AGT en extractos celulares. Esta relación actividad/solubilidad es válida para aquellas formas en que la mutación conlleva agregación proteica. 3. Los ensayos realizados con chaperones químicos que habían mostrado previamente mejoras en la solubilidad de AGT*LTM expresada en células de mamífero, confirmaron que el compuesto quinacrina aumenta la solubilidad de la proteína mutante expresada en E.coli. 4. La caracterización físico-química de las formas no patológicas de AGT concluyen en la ausencia de diferencias entre ellas en cuanto a su comportamiento hidrodinámico y estructura secundaria se refiere. Sin embargo, existen diferencias frente a la proteína silvestre y AGT*R que guardan relación con las propiedades espectroscópicas en el UV cercano y el visible conferidas por la unión del PLP. En cuanto a la estabilidad térmica de estas formas la mayoría de los cambios respecto a AGT*WT, salvo I340M, suponen una desestabilización. AGT*LM muestra claramente una estabilidad menor, de la que el polimorfismo P11L es el único responsable. Al igual sucede con AGT*T y AGT*R aunque en menor grado. Es predecible que AGT*LTM y AGT*LRM sean mucho más inestables, como resultado de la sinergia de los cambios. 5. El análisis funcional de nuevas mutaciones halladas por nuestro grupo en pacientes de HOP1 ha dado información respecto a alguno de esos cambios. El cambio S218L es responsable directo de la reducción de la actividad con independencia de su efecto en la solubilidad. Los cambios R197Q y R381K parecen no tener grandes efectos en la solubilidad de AGT. Además, el cambio R381K no muestra grandes diferencias frente a AGT*WT cuando analizamos su actividad en la fracción soluble de un extracto crudo y la actividad de AGT*LKM es similar a la mostrada por AGT*LM. En contraposición, la forma AGT*L197QM muestra valores inferiores a los presentados por AGT*LM aunque similares a los de la forma AGT*L no considerada patológica. La aparición de ambos cambios en cis, hace sospechar que quizás actúen de manera sinérgica. La sustitución D210E provoca modificaciones similares a las originadas por el cambio G170R. En ambos casos cuando la mutación está presente en el haplotipo major la proteína es correctamente importada al peroxisoma mientras que cuando la mutación se presenta en el haplotipo minor es importada a la mitocondria. Finalmente, la mutación H83R no provoca la agregación mayoritaria de AGT al ser expresada en E.coli, independientemente del haplotipo en el que se encuentre. Sin embargo, es la responsable absoluta de la ausencia de actividad específica. La caracterización físico-química de AGT*83R y AGT*L83RM confirma grandes diferencias con respecto a AGT*WT y AGT*LM en las propiedades espectroscópicas que confiere la unión del PLP. 6. La glicolato oxidasa de ratón (mGO) consiste en un tetrámero cuyos monómeros se relacionan mediante un eje de simetría cuaternario y presentan la estructura de barril ¿/ß característica. Posee una especie de tapa constituida por 31 aminoácidos (desde L177 hasta V209), que se corresponde con la zona de mayor movilidad de la enzima. La comparación de las diferentes estructuras resueltas (mGO_glioxilato: loop cerrado y mGO_E7: loop abierto) permite postular el mecanismo de apertura y cierre de dicha tapa. En el centro activo el Trp110 se sitúa entre el glioxilato y el loop actuando como la tapa que aísla la reacción del medio, las restricciones geométricas del Trp110 y el impedimento estérico observados al comparar la estructura abierta y la estructura cerrada indican que el cambio de conformación del Trp110 implica necesariamente la apertura de la tapa. El conocimiento de la estructura de la glicolato oxidasa de ratón, de su centro activo y el mecanismo de apertura y cierre del loop de acceso a dicho centro activo es un primer paso en la búsqueda de compuestos que pudieran inhibirla sin causar efectos no deseados sobre otras enzimas similares.