Molecular mechanisms underlying primary hyperoxaluria type 1 and new therapeutic approaches

Resum

Molecular Mechanisms Underlying Primary Hyperoxaluria Type 1 and New Therapeutic Approaches. Noel Mesa Torres. Programa de Doctorado en Química. Universidad de Granada. RESUMEN: La hiperoxaluria primaria tipo 1 (HP1) es una enfermedad genética autosómica recesiva causada por mutaciones sobre el gen AGXT que codifica para la enzima alanina:glioxilato aminotransferasa (AGT) (Danpure, 1986). El gen AGXT presenta dos polimorfismos no patogénicos: el más común alelo mayor, y el denominado alelo menor, el cual es más fre- cuente en pacientes La función biológica de la enzima humana AGT es crear un sumidero de glioxilato en los peroxisomas de hepatocitos mediante la transaminación de L-alanina a piru- vato y glioxilato a glicina en presencia del coenzima piridoxal-5¿-fosfato (PLP) (Purdue et al., 1990; Danpure et al., 1993). La deficiencia en la función de la enzima AGT provoca la acumu- lación de glioxilato, el cual puede oxidarse hasta oxalato. La formación de cristales de oxalato cálcico conduce a un progresivo fallo renal y a la deposición de oxalato en todo el organismo provocando un fallo sistémico (Salido et al., 2012). Solo un número limitado de genotipos han mostrado respuesta al tratamiento farmacológico con piridoxina (precursor de PLP), y el único tratamiento genérico es el transplante simultáneo de hígado y riñón, el cual está asociado con unos altos niveles de morbilidad y mortalidad (Cochat et al., 2012). Más de 150 mutaciones han sido encontradas sobre el gen AGXT y varios mecanismos moleculares parecen contribuir a la pérdida de función de la enzima AGT, tales como localización errónea en mitocondria, agregación, degradación acelerada o defectos catalíticos (Williams et al., 2009). En esta tesis: 1) Hemos realizado un estudio in vitro para caracterizar los polimorfismos no patogénicos y causantes de enfermedad más comunes para obtener información sobre los mecanismos de la enfermedad. Hemos encontrado una baja estabilidad cinética del estado apo de las mutaciones de HP1 sobre el alelo menor, la cual es corregida mediante la unión del coenzima mediante estabilización del estado nativo (Pey et al., 2011). Además, hemos observado una correlación parcial entre la desestabilización del estado apo del dímero, y el aumento de estados parcial- mente plegados asociados a chaperonas moleculares, reducción de la plegabilidad y aumento de la localización subcelular errónea en células (Wickner et al., 1999; Frydman, 2001; Hartl et al., 2011; Kim et al., 2013). Esto sugiere que la homeostasis proteica juega un papel importante en la patogenicidad de HP1. 2) Con el objetivo the aumentar nuestro conocimiento sobre la interacciones in vivo de la enz- ima AGT con diferentes elementos del sistema de homeostasis proteica durante su plegamiento, hemos considerado el empleo del nemátodo C. elegans como posible modelo para la HP1 (Markaki and Tavernarakis, 2010; Calamini et al., 2012). Para ello hemos realizado la caracter- ización in vitro de una proteína ortóloga de la enzima AGT humana en C. elegans y discutido el papel del glioxilato en este nemátodo con el fin de crear un fenotipo de hiperoxaluria. 3) Hemos aplicado la aproximación de consenso para diseñar una enzima AGT humana mejo- rada que pueda ser potencialmente usada en terapia génica o reemplazamiento enzimático (Lehmann and Wyss, 2001; Salido et al., 2006; Margaritis et al., 2011). Esta simple aproxi- mación ha resultado adecuada para incrementar la actividad y estabilidad in vitro de la enzima AGT mediante la mejora de las interacciones de la estructura nativa. El empleo de esta aproxi- mación para mejorar la terapia génica y de reemplazamiento enzimático está aún bajo estudio.Sin embargo, la mejora obtenida en el proceso de cristalización de variantes de consenso sug- iere que esta aproximación podría también ser empleada como una estrategia simple para la cristalización de proteínas con problemas de estabilidad. 4) Finalmente, también hemos estudiado las bases energéticas que subyacen los efectos mu- taciones sobre la estabilidad de la enzima AGT, considerando desde variantes no patogénicas, patogénicas y de consenso. Los estudios por desnaturalización química y térmica indican que la estabilidad cinética de la enzima AGT humana depende de cambioes en la estabilidad termod- inámica y en la propensidad a fenómenos de agregación de los estados desplegados o parcial- mente desplegados, donde la existencia de un límite inferior de estabilidad y plegabilidad, para el alelo menor, puede explicar la alta frecuencia de mutantes HP1 que afectan al plegamiento, destacando el papel principal de chaperonas moleculares en la patogenicidad (Godoy-Ruiz et al., 2006; Rodriguez-Larrea et al., 2006; Sanchez-Ruiz, 2010). Referencias: - Calamini, B.; Silva, M. C.; Madoux, F.; Hutt, D. M.; Khanna, S.; Chalfant, M. A.; Saldanha, S. A.; Hodder, P.; Tait, B. D.; Garza, D.; Balch, W. E.; Morimoto, R. I. Nat Chem Biol 2012, 8, 185¿96. - Cochat, P.; et al. Nephrol Dial Transplant 2012, 27, 1729¿36. - Danpure, C. J. Lancet 1986, 2, 1168. - Danpure, C. J.; Purdue, P. E.; Fryer, P.; Griffiths, S.; Allsop, J.; Lumb, M. J.; Guttridge, K. M.; Jennings, P. R.; Scheinman, J. I.; Mauer, S. M. Am J Hum Genet 1993, 53, 417¿32. - Frydman, J. Annu Rev Biochem 2001, 70, 603¿47. - Godoy-Ruiz, R.; Ariza, F.; Rodriguez-Larrea, D.; Perez-Jimenez, R.; Ibarra-Molero, B.; Sanchez-Ruiz, J. M. J Mol Biol 2006, 362, 966¿78. - Hartl, F. U.; Bracher, A.; Hayer-Hartl, M. Nature 2011, 475, 324¿32. - Kim, Y. E.; Hipp, M. S.; Bracher, A.; Hayer-Hartl, M.; Hartl, F. U. Annu Rev Biochem 2013, 82, 323¿55. - Lehmann, M.; Wyss, M. Curr Opin Biotechnol 2001, 12, 371¿5. - Margaritis, P.; Roy, E.; Faella, A.; Downey, H. D.; Ivanciu, L.; Pavani, G.; Zhou, S.; Bunte, R. M.; High, K. A. Blood 2011, 117, 3974¿82. - Markaki, M.; Tavernarakis, N. Biotechnol J 2010, 5, 1261¿76. - Pey, A. L.; Salido, E.; Sanchez-Ruiz, J. M. Amino Acids 2011, 41, 1233¿45. - Purdue, P. E.; Takada, Y.; Danpure, C. J. J Cell Biol 1990, 111, 2341¿51. - Rodriguez-Larrea, D.; Ibarra-Molero, B.; Sanchez-Ruiz, J. M. Biophys J 2006, 91, L48¿50. - Salido, E. 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