Isótopos estables para la especiación cuantitativa de zinc en leche y para investigar la biodisponibilidad y metabolismo de nuevos fortificantes de hierro en leche fórmula

Resumen

Los elementos traza esenciales (i.e. Fe, Cu, Zn, Se, I) están presentes en el organismo en muy pequeñas concentraciones (μg/g, ng/g), pero son de vital importancia para el correcto desarrollo y funcionamiento del organismo. Un balance negativo de algún elemento traza puede resultar en desórdenes distintivos de deficiencia, como la anemia en los individuos deficientes en hierro. De igual forma, un consumo por exceso de elementos traza, resulta tóxico. En el caso de los recién nacidos, especialmente durante los primeros meses de vida, su única fuente de nutrientes es a través de la leche materna, constituyendo un alimento ideal para el recién nacido, puesto que proporciona todos los nutrientes necesarios para cubrir sus necesidades. En concreto, proporciona elementos traza esenciales en las concentraciones adecuadas y en formas fisicoquímicas que presentan una elevada absorción y biodisponibilidad. Adicionalmente, se conoce que la composición de la leche materna varía a lo largo del periodo de lactancia y la edad gestacional adaptándose a las necesidades nutricionales del recién nacido. Por otro lado, las leches fórmula utilizadas para la alimentación del recién nacido como sustitución de la leche materna, están generalmente fortificadas en dichos elementos con objeto de evitar enfermedades derivadas de su deficiencia, pero la absorción y biodisponibilidad de los elementos desde dichas leches fórmula suele ser inferior a la observada desde leche materna. Por tanto, el objetivo general de la presente Tesis Doctoral consistió en el uso de “isótopos estables para la especiación cuantitativa de zinc en leche y para investigar la biodisponibilidad y metabolismo de nuevos fortificantes de hierro en leche fórmula”. Este objetivo general se ha perseguido abordando los siguientes objetivos específicos: I) Estudio del contenido de zinc y/o especies de zinc en leche materna: variación con el período de lactancia y la edad gestacional. Conocer el aporte de zinc desde la leche materna, así como las formas fisicoquímicas en las que está presente, resulta de gran interés puesto que este elemento está involucrado en el desarrollo psíquico, físico y motor del recién nacido. Se evaluó mediante ICP-MS la variación de los niveles y de las especies de Zn presentes en la leche materna (n= 124) a lo largo del periodo de lactancia: calostro, leche de transición (7,14 días tras el parto) y leche madura (28 días tras el parto) y dependiendo de la edad gestacional diferenciando entre parto pretérmino (<36 semanas) y parto a término (>36 semanas). A modo comparativo, se analizaron diferentes fórmulas lácteas comerciales destinadas a la alimentación de niños a término y pretérmino (n=16). Los resultados del estudio mostraron que los niveles de Zn variaban a lo largo del periodo de lactancia, desde el calostro hasta la leche madura. Sin embargo, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas con la edad gestacional. Los estudios de especiación del Zn en la leche materna por SEC-ICP-MS y dilución isotópica post columna mostraron que la mayor parte del Zn eluye asociado a compuestos de bajo peso molecular, dicha especie fue identificada por espectrometría de masas moleculares como citrato. Asimismo, no se encontraron diferencias en las especies presentes en los distintos tipos de leche (a término y pretérmino) a lo largo del periodo de lactancia. Los resultados de análisis de leches formula (destinadas a la alimentación del recién nacido prematuro y a término) mostraron unos niveles de Zn similares a los encontrados en leche madura, tanto a término como pretérmino. Respecto a las especies presentes, el Zinc se encontró principalmente asociado a citratos y sales de bajos pesos moleculares. II) Evaluación de la biodisponibilidad/absorción y metabolismo del hierro desde leche fórmula fortificada con un complejo de 57Fe(III)-Lactoferrina y 57Fe(II)SO4 en presencia de Lactoferrina. El hierro en la leche materna se encuentra principalmente asociado a proteínas (de alto, medio y bajo peso molecular) las cuales presentan una biodisponibilidad y absorción superior a la encontrada en leches fórmulas fortificadas con hierro, generalmente en forma de sulfato ferroso. Con el objetivo de mejorar la absorción de las leches fórmula, la búsqueda de nuevas formas fisicoquímicas de hierro, similares a las encontradas en leche materna, resulta de gran interés. Asimismo, resulta interesante la búsqueda de co-fortificantes que incrementen la absorción y biodisponibilidad del hierro desde el sulfato ferroso o incluso que permita alcanzar un adecuado estatus de hierro utilizando menores dosis. Para ambos propósitos, en el presente capítulo se evaluó en ratas lactantes el papel de la lactoferrina, una proteína presente en la leche materna capaz de ligar al hierro, en la absorción/biodisponibilidad del hierro desde leches fórmula de dos maneras: mediante una nueva forma fisicoquímica, el complejo hierro-lactoferrina (Fe(III)2-Lf) y, por otro lado, el posible efecto de la lactoferrina (Lf) en la absorción del FeSO4. Ambos compuestos de hierro fueron sintetizados con un isótopo enriquecido de hierro (57Fe) y posteriormente caracterizados (en términos de estabilidad, concentraciones y abundancias). Se desarrolló una metodología basada en el empleo de isotopos estables de Fe en combinación con ICP-MS para la medida de los tejidos y fluidos de ratas alimentadas con los diferentes fortificantes ensayados. Dicha herramienta, denominada Isotope Pattern Deconvolution (IPD) permite calcular el contenido de Fe endógeno (presente en la rata de manera natural) y exógeno (trazador, 57Fe utilizado como alimento) presentes en los diversos compartimentos en los cuales el hierro se distribuye dentro del organismo (funcional en los RBCs, transporte en el suero y almacenamiento en el hígado). Asimismo, se calculó la absorción y retención aparente para los diversos fortificantes ensayados. Los resultados de absorción y/o retención aparentes observados en este trabajo indican que los principales factores que influyen a ambos parámetros son la dosis y la forma química del hierro (por ejemplo 57Fe(II)SO4 + Lf es claramente preferible al complejo 57Fe(III)-Lf para aumentar la absorción del Fe). El intercambio de 57Fe fue del 50% en los glóbulos rojos, cercano al 70% en suero. Ello apunta a una rotación o intercambio más rápido del hierro exógeno (57Fe) en el suero que en los glóbulos rojos. Los niveles más elevados de 57Fe en hígado se encontraron cuando éste fue administrado como 57Fe(II)SO4 en presencia de lactoferrina (73% de incorporación del 57Fe). Por otra parte, el hierro exógeno encontrado en riñones fue inferior al 8%, lo que indica una bajas tasa de intercambio de hierro en este órgano. Teniendo en cuenta los resultados encontrados mediante HPLC-ICP-MS (con cuantificación mediante IPD post-columna), el hierro en el compartimento funcional resultó ser muy similar en todos los grupos estudiados, siendo sólo superior en el grupo fortificado con mayores dosis de hierro. Las subunidades de hemoglobina separadas por cromatografía de intercambio catiónico se identificaron en este trabajo y mostraron la misma incorporación de hierro en ambas isoformas, como se esperaba. En el "hierro circulante" encontramos importantes diferencias en los grupos fortificados en comparación con el grupo control (alimentación materna). De hecho, el 77% del hierro total se encontró asociado a transferrina en el grupo materno. Este hecho importante no se observó en los otros grupos, donde el porcentaje de hierro total en transferrina fue siempre inferior al 10% (es decir, la especiación de Fe en la leche materna es claramente diferente a la de las fórmulas). La distribución de hierro en el compartimento de almacenamiento parece estar relacionada principalmente con la dosis de los elementos administrados: como se esperaba, una mayor ingesta de hierro conduce a mayores niveles de hierro hepático, lo que confirma el papel crítico del compartimento de almacenamiento en el metabolismo del hierro y la homeostasis. Los resultados también revelan que la forma fisicoquímica utilizada para la fortificación no es un factor decisivo en el almacenamiento de hierro, ya que no hay diferencias significativas en los niveles de hierro (o incorporación de 57Fe) cuando el hierro se fortifica en forma ferrosa o férrica. En cuanto a la incorporación de hierro 57Fe (exógeno) entre los grupos ensayados, está claro que los mejores resultados se obtuvieron cuando el hierro se fortificó como Fe(II)SO4 en presencia de lactoferrina. Comparando tales resultados con los descritos previamente por otros autores [Héctor et al. Electrophoresis, 33:15 (2012) 2407–15] usando la misma dosis de Fe(II)SO4 pero sin lactoferrina, se puede ver que la Lf claramente aumentó la absorción de hierro. De nuevo, la forma fisicoquímica del elemento utilizado para la fortificación, así como su dosis, fueron aspectos clave para aumentar la biodisponibilidad y absorción del elemento. III) Evaluación de la biodisponibilidad/absorción y metabolismo del hierro desde leche fórmula fortificada con un isótopo estable de hierro en forma de nanopartículas de 57Fe-NPs. Durante los últimos años, el uso de nanopartículas como suplementos nutricionales ha ido en aumento, generando resultados muy prometedores, puesto que parecen causar menores efectos secundarios en el tracto gastrointestinal, además de tener gran estabilidad. Por otro lado, aunque el uso de nanopartículas como fortificantes en alimentos no resulta tan común, los estudios disponibles actualmente muestran que el uso de las nanopartículas como fortificantes de elementos traza esenciales en alimentos puede ser prometedor puesto que parecen general pocos cambios sensoriales en el alimento, y en algunos casos, una liberación del elemento más controlada, presentando además mayor biodisponibilidad. En el presente capítulo se ha reproducido la síntesis de unas nanopartículas de oxo-hidróxido de Fe (III) patentada por Powell et al. (U.K. patent WO/2008/096130 2008 06.02.2008) pero utilizando un isótopo de hierro enriquecido (57Fe). La estructura de estas nanopartículas resulta muy similar a la nanoestructura formada en el interior de la ferritina como método de almacenamiento natural de hierro dentro del organismo, por lo que es de suponer que su biodisponibilidad será alta y sus efectos adversos serán menores a los encontrados en otras nanopartículas de hierro. Para estudiar el metabolismo, absorción y biodisponibilidad de las nanopartículas de oxo-hidróxido de hierro (III), se ha alimentado un grupo de ratas lactantes con leche fortificada con dichas nanopartículas a una concentración de hierro dada. A modo comparativo con el grupo anterior, se utilizó un grupo de ratas alimentadas con leche fórmula sin fortificación, y finalmente, un grupo de alimentación materna utilizada como grupo control. Dichas nanopartículas fueron sintetizadas y posteriormente caracterizadas en términos de tamaño, morfología, concentración, etc. Al igual que en el capítulo anterior, se utilizó la herramienta matemática IPD para llevar a cabo la determinación de hierro endógeno y exógeno (proveniente de la nanopartícula) total en los diferentes compartimentos de hierro (funcional, transporte y almacenamiento) en muestras biológicas. Los resultados obtenidos tras el estudio in vivo mostraron que la fortificación de hierro en leche fórmula es necesaria para mantener un adecuado estatus de hierro en el organismo. Por otro lado, la incorporación de hierro exógeno (57Fe) en suero, eritrocitos e hígado desde las NPs estudiadas fue superior al 57%. Dicha incorporación en sangre (suero y eritrocitos) fue ligeramente inferior a la encontrada en el capítulo anterior para otros fortificantes, pero en el hígado se observó una mayor incorporación a pesar de llevar a cabo la fortificación con una dosis baja de hierro. A través de la medida del hierro excretado, se obtuvo la absorción aparente de dichas nanopartículas, resultando ser de un 91%. Igualmente, se llevó a cabo la especiación mediante HPLC-ICP-MS y la cuantificación del hierro exógeno y endógeno mediante IPD, en las muestras anteriormente mencionadas. La especiación de hierro en el compartimento funcional (eritrocitos), mostró que existe poca variación entre grupos en este compartimento, lo que demuestra el mecanismo altamente regulado de hierro en el organismo. La especiación de suero de rata mostró la importancia de la fortificación con hierro en leche de fórmula para mantener un adecuado estatus de hierro en el compartimento de transporte, ya que mostraron concentraciones de hierro significativamente mayores en la fracción atribuida a la transferrina. En el hígado, los niveles encontrados para el grupo de NPs fueron superiores al grupo no fortificado, pero inferiores a los encontrados anteriormente en el grupo alimentado con leche fórmula fortificada con FeSO4 + Lf. No obstante, el 57Fe se incorporó adecuadamente a las especies encontradas en eritrocitos, suero y hígado de rata desde las partículas ensayadas, mostrando que éstas se metabolizaron adecuadamente. El uso de las 57Fe-NPs como fortificante de leche puede representar una buena alternativa para la fortificación con hierro en las leches fórmula.