Soil microbial response to biotransformed dry olive residue used as organic amendment

Resumen

Los suelos de la cuenca Mediterránea están sufriendo un proceso de degradación y pérdida de fertilidad debido a las agresivas técnicas de laboreo, relacionadas con la agricultura intensiva, a las que están siendo sometidos (Badalucco et al., 2010). El uso de enmendantes orgánicos se ha sugerido como una estrategia viable para la mejora de las propiedades físicas, químicas y biológicas de estos suelos (Thangarajan et al., 2013). La industria del aceite de oliva produce en esta región ingentes cantidades de residuos, entre ellos, el ¿alpeorujo seco y extractado¿ o DOR (del inglés ¿dry olive residue¿) (Morillo et al., 2009). Este residuo, del que se producen cada año en España 5 millones de toneladas (Tortosa et al., 2012), se caracteriza por presentar un alto contenido en materia orgánica y estar libre de patógenos así como metales pesados (Lopez-Pineiro et al., 2007). Por ello, su aplicación como enmendante orgánico supondría un aspecto beneficioso para el suelo, además de una forma idónea de revalorización de este subproducto. Sin embargo, la aplicación directa de este residuo al suelo puede alterar este ecosistema debido a su pH ácido, elevada salinidad y relación C/N así como su alto contenido en fenoles, los cuales presentan actividad fitotóxica (Ntougias et al., 2013). Por ello, el alpeorujo necesita un tratamiento antes de su uso como enmendante orgánico (Sampedro et al., 2009a). Estudios previos han mostrado que los hongos saprobios son capaces de transformar este residuo, gracias a su eficaz maquinaria enzimática, mejorando su grado de humificación, disminuyendo la relación C/N y reduciendo su contenido fenólico y por tanto, su fitotoxidad (Sampedro et al., 2009b). Los microorganismos del suelo llevan a cabo funciones importantes en este medio como la transformación y mineralización de la materia orgánica, participación en los ciclos de los nutrientes, establecimiento de relaciones simbióticas o antagonistas con las plantas y eliminación de compuestos recalcitrantes (Kirk et al., 2004; Trevors, 2010; Orgiazzi et al., 2012; Rincon-Florez et al., 2013). De esta forma, cuando se aplican al suelo determinadas prácticas, como el uso de enmendantes orgánicos, que pueden alterar las comunidades microbianas del mismo, es necesario conocer su impacto en dichas comunidades (Chaudhry et al., 2012). Se conoce poco sobre el efecto que el uso del DOR transformado por hongos saprobios tiene en las comunidades bacterianas y fúngicas del suelo. Por ello, el principal objetivo de la presente Tesis Doctoral fue conocer el impacto del alpeorujo transformado por hongos saprobios, usado como enmendante orgánico, sobre la microbiología del suelo. Asimismo, otro objetivo del presente trabajo fue la descripción de la diversidad de la comunidad bacteriana y fúngica de un suelo Mediterráneo, ya que a pesar de ser una de las zonas de mayor diversidad de la Tierra (Myers et al., 2000), su conocimiento es todavía limitado. Para llevar a cabo el estudio, se realizó un experimento consistente en suelo sin enmendar (suelo control) y suelo enmendado al 5% (peso-peso) con: DOR sin transformar, DOR transformado por Coriolopsis floccosa (CORDOR) o DOR transformado por Fusarium oxysporum (FUSDOR), utilizando sorgo como planta y el cual fue llevado a cabo en condiciones contraladas de humedad y luz en invernadero. Tras el paso de 0, 30 y 60 días, se determinaron las principales propiedades químicas del suelo en los distintos tratamientos y los cambios en la abundancia, composición filogenética y funcionalidad de las comunidades bacterianas y fúngicas. En el capítulo ¿Shifts in soil chemical properties and bacterial communities responding to biotransformed dry olive residue used as organic amendment¿, se comprobó que la transformación del residuo con ambos hongos cambió las propiedades químicas del mismo, aunque C. floccosa fue más efectivo en la biorremediación. El análisis del peso de las plantas de sorgo mostró que DOR tuvo un efecto fitotóxico sobre las mismas, que no se detectó en el caso de los tratamientos con CORDOR y FUSDOR. La aplicación de los tres residuos como enmendantes produjo en el suelo una disminución inmediata del pH y un aumento del contenido fenólico, efecto que solo se mantuvo hasta el final del experimento en el caso del suelo enmendado con DOR. Por otro lado, la administración de los distintos enmendantes conllevó un aumento del contenido de materia orgánica del suelo, debido a un incremento de carbono total, carbono orgánico y carbono soluble en agua. Estos incrementos en carbono orgánico detectados en el suelo y la limitada entrada de nitrógeno con estos enmendantes supusieron un aumento de la relación C/N, destacando en el caso de la aplicación de DOR. Respecto a los diferentes minerales determinados, los tres enmendantes incrementaron sólo el contenido de K en los tres tiempos de muestreo. Los análisis mediante qPCR (PCR cuantitativa) del gen 16S rRNA y PLFA (análisis de ácidos grados de fosfolípidos) mostraron que la comunidad bacteriana fue más abundante después de la aplicación de todos los enmendantes mientras que la comunidad actinobacteriana aumentó con DOR a los 30 días y con CORDOR y FUSDOR a los 60 días. Los análisis de DGGE (electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante) de la comunidad bacteriana y actinobacteriana mostraron algunos cambios en sus estructuras, especialmente a los 60 días, aunque no fue posible detectar un efecto diferenciado de cada enmendante sobre ambas comunidades, como sí mostró el estudio de los datos de PLFA. Finalmente, el análisis de principales componentes mostró que la enmienda del suelo con DOR supone el mayor impacto sobre las propiedades químicas y biológicas del suelo, especialmente a 30 días. En el capítulo ¿Assessing the impact of biotransformed dry olive residue application to soil: Effects on enzyme activities and fungal community¿ se determinó que CORDOR y FUSDOR produjeron estimulación de las actividades fosfatasa, ß-glucosidasa, proteasa y deshidrogenasa mientras que no se observaron cambios en el caso de la actividad ureasa en los distintos tiempos de análisis. Sin embargo, cuando se añadió DOR al suelo se observó un descenso de las actividades fosfatasa, ß-glucosidasa y ureasa. La abundancia fúngica analizada mediante qPCR del gen 18S rRNA aumentó en los tratamientos con DOR mientras que en los que contenían CORDOR y FUSDOR sólo se incrementó a los 60 días, siendo más significativo este incremento en el suelo enmendado con CORDOR. La estructura de la comunidad fúngica analizada mediante DGGE del gen 18S rRNA se alteró en presencia de los distintos enmendantes y se observó un ligero incremento de la diversidad fúngica tras la adición de DOR a los 60 días. La secuenciación de bandas del DGGE de este tratamiento mostró que varias especies fúngicas, como Chaetomium globosum y Chalazion helveticum, se vieron favorecidas tras la aplicación de CORDOR como enmendante. En el capítulo ¿Short-term dynamics of culturable bacteria in a soil amended with biotransformed dry olive residue¿ se valoró la composición de la comunidad bacteriana cultivable de un suelo Mediterráneo y sus cambios tras añadir los diferentes enmendantes. Del total de 1800 cepas aisladas, 900 se seleccionaron y analizaron mediante sus patrones de FAMEs (ésteres metílicos de ácidos grasos), así como secuenciación parcial del gen 16S rRNA. Tras el análisis, se comprobó que la comunidad bacteriana cultivable de este suelo estaba dominada por Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria, Bacilli, Sphingobacteria y Cytophagia. La aplicación de los residuos como enmendantes produjo un aumento del número de CFUs (unidades formadores de colonias) y bacterias viables, más destacado en el caso del DOR. DOR alteró la diversidad y estructura de la comunidad fúngica a lo largo de todo el ensayo mientras que CORDOR produjo los mayores cambios inmediatamente después de la aplicación (2 días), principalmente por la proliferación de bacterias del género Arthrobacter. En el capítulo ¿Effects of dry olive residue transformed by Coriolopsis floccosa (Polyporaceae) on the distribution and dynamic of a culturable fungal soil community¿ se valoró la composición fúngica cultivable del suelo Mediterráneo objeto de estudio, así como sus cambios después de la aplicación de DOR y CORDOR como enmendante. Para ello, se aislaron un total de 1733 cepas de los distintos tratamientos que se agruparon en distintos morfotipos, los cuales se identificaron mediante secuenciación de la región ITS o los genes 28S rRNA y ß-tubulina. La diversidad fúngica cultivable estaba compuesta por Hypocreales, Eurotiales, Capnodiales, Sordariales y Pleosporales. Por otro lado, se observó que DOR y CORDOR no produjeron cambios importantes en la diversidad fúngica ya que sólo se detectó un ligero descenso de la diversidad en el tratamiento con DOR a los 30 días. De esta forma, se concluyó que los mayores efectos mediados por los residuos usados como enmiendas eran debidos a cambios en la estructura fúngica. De hecho, CORDOR produjo cambios de la estructura fúngica inmediatamente después de su aplicación, aunque esta modificación no permaneció, como mostró el análisis multivariante, a lo largo del ensayo a los 30 y 60 días. En cambio, DOR produjo cambios en la estructura fúngica cultivable del suelo estudiado en los distintos tiempo de análisis, principalmente por la proliferación de especies como Cladosporium cladosporioides, F. oxysporum y Fusarium scirpi. En el último capítulo de la presente Tesis Doctoral, ¿Microbial diversity of a Mediterranean soil and its changes after biotransformed dry olive residue amendment¿, se estudió la composición filogenética de la comunidad bacteriana y fúngica del suelo mediante pirosecuenciación de los genes 16S rRNA y 28S rRNA para bacterias y hongos respectivamente. La comunidad bacteria estaba formada por Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Gemmatimonadetes y Firmicutes, mientras que en la comunidad fúngica destacaron Ascomycota y Basidiomycota. Los cambios en la funcionalidad del suelo tras los distintos tratamientos con los residuos transformados se determinaron mediante los CLPPs (perfiles fisiológicos a nivel de comunidad) usando las Biolog Ecoplates. DOR y CORDOR usados como enmendantes disminuyeron la diversidad funcional a los 30 y 60 días y produjeron cambios en la estructura funcional de la comunidad microbiana. Cabe destacar que el CORDOR fue el residuo que produjo los cambios más llamativos tanto en la diversidad como en la estructura de esta comunidad microbiana. Estos cambios en la funcionalidad del suelo fueron en paralelo con los descritos en la estructura filogenética de las comunidades bacterianas y fúngicas así como con un descenso de la diversidad bacteriana en el suelo enmendado con DOR a 30 días y un aumento de la diversidad fúngica en las muestras con CORDOR a los 60 días. Los cambios en la estructura microbiana vinieron determinados por el incremento de la relativa abundancia de algunos grupos bacterianos y fúngicos y el descenso de otros Referencias Badalucco, L., Rao, M., Colombo, C., Palumbo, G., Laudicina, V.A., and Gianfreda, L. (2010) Reversing agriculture from intensive to sustainable improves soil quality in a semiarid South Italian soil. Biology and Fertility of Soils 46: 481-489. Chaudhry, V., Rehman, A., Mishra, A., Chauhan, P.S., and Nautiyal, C.S. (2012) Changes in bacterial community structure of agricultural land due to long-term organic and chemical amendments. Microbial Ecology 64: 450-460. Kirk, J.L., Beaudette, L.A., Hart, M., Moutoglis, P., Klironomos, J.N., Lee, H., and Trevors, J.T. (2004) Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods 58: 169-188. Lopez-Pineiro, A., Murillo, S., Barreto, C., Munoz, A., Rato, J.M., Albarran, A., and Garcia, A. (2007) Changes in organic matter and residual effect of amendment with two-phase olive-mill waste on degraded agricultural soils. Science of the Total Environment 378: 84-89. Morillo, J.A., Antizar-Ladislao, B., Monteoliva-Sánchez, M., Ramos-Cormenzana, A., and Russell, N.J. (2009) Bioremediation and biovalorisation of olive-mill wastes. Applied Microbiology and Biotechnology 82: 25-39. Myers, N., Mittermeier, R.A., Mittermeier, C.G., da Fonseca, G.A., and Kent, J. (2000) Biodiversity hotspots for conservation priorities. Nature 403: 853-858. Ntougias, S., Bourtzis, K., and Tsiamis, G. (2013) The microbiology of olive mill wastes. BioMed Research International 2013: 784591. Orgiazzi, A., Lumini, E., Nilsson, R.H., Girlanda, M., Vizzini, A., Bonfante, P., and Bianciotto, V. (2012) Unravelling soil fungal communities from different Mediterranean land-use backgrounds. PLoS One 7: e34847. Rincon-Florez, V.A., Carvalhais, L.C., and Schenk, P.M. (2013) Culture-independent molecular tools for soil and rhizosphere microbiology. Diversity 5: 581-612. Sampedro, I., Cajthaml, T., Marinari, S., Petruccioli, M., Grego, S., and D¿Annibale, A. (2009a) Organic matter transformation and detoxification in dry olive mill residue by the saprophytic fungus Paecilomyces farinosus. Process Biochemistry 44: 216-225. Sampedro, I., Cajthaml, T., Marinari, S., Stazi, S.R., Grego, S., Petruccioli, M. et al. (2009b) Immobilized inocula of white-rot fungi accelerate both detoxification and organic matter transformation in two-phase dry olive-mill residue. Journal of Agricultural and Food Chemistry 57: 5452-5460. Thangarajan, R., Bolan, N.S., Tian, G., Naidu, R., and Kunhikrishnan, A. (2013) Role of organic amendment application on greenhouse gas emission from soil. Science of The Total Environment 465: 72-96. Tortosa, G., Alburquerque, J.A., Ait-Baddi, G., and Cegarra, J. (2012) The production of commercial organic amendments and fertilisers by composting of two-phase olive mill waste (¿alperujo¿). Journal of Cleaner Production 26: 48-55. Trevors, J.T. (2010) One gram of soil: a microbial biochemical gene library. Antonie Van Leeuwenhoek 97: 99-106.