Estudio comparativo del efecto del estrés salino en plantas de tomate. Influencia de la variabilidad genotípica

Resumen

Uno de los mayores retos de la agricultura mundial a día de hoy es cubrir las necesidades de producción de alimentos a nivel mundial, problema que crece cada año debido al crecimiento poblacional. Una de las soluciones es incrementar el porcentaje de tierras de cultivo disponibles para satisfacer esta demanda. En este sentido, la FAO (1990-2016) ha registrado un aumento del porcentaje de tierras de cultivo en los últimos años. Sin embargo, no todas las tierras de cultivo presentan unas condiciones adecuadas para cultivar en ellas (FAO et al. 2012). Efectivamente, muchos suelos cultivables suelen presentar elevadas concentraciones de sales solubles, como el NaCl, que son perjudiciales para el desarrollo óptimo de muchos cultivos agrícolas. La salinidad está causada principalmente por esta acumulación excesiva de sales en el suelo, afectando al crecimiento y desarrollo de las plantas. El NaCl es la sal más soluble y extendida que provoca estrés salino a las plantas, por lo que algunas plantas presentan mecanismos de tolerancia (Munns 2009; Sheng et al. 2010). Sin embargo, a veces no resultan lo suficientemente eficientes generando deficiencias nutricionales, alteración del metabolismo y otros daños. La salinización de los cultivos puede darse por muchos factores, entre ellos la salinización por riego. Se estima que en torno a un tercio de la superficie mundial de las tierras agrícolas con riego están afectadas por la salinidad, y se prevé que aumente el porcentaje en el futuro (Mateo-Sagasta y Burke 2010; Abbas et al. 2013). Esto es especialmente grave, ya que la superficie agrícola con regadío genera más de un tercio de la producción mundial a pesar de que constituye solo un 15% de la superficie cultivable mundial (Munns y Tester 2008). El cultivo de tomate es uno de los cultivos más extendidos y de mayor valor económico que no ha parado de crecer en los últimos años. Los datos de la FAO registran que aproximadamente cada 10 años el crecimiento de la producción de tomate aumenta en torno a 50 millones de toneladas (Mt), y el área de cultivo dedicado a estos crece aproximadamente 1 millón de ha (Mha), a nivel mundial (FAO 1994-2017). Según los últimos datos proporcionados por el servicio de estadisticas de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agriculcura para 2017 (FAOSTAT), el área cultivada de tomate a nivel mundial es de casi 5 Mha, teniendo una producción en la misma de aproximadamente 182 Mt (FAO 1994-2017). En España los datos recogidos por el anuario de estadística agraria reflejan una producción de tomate de alrededor de 5.2 Mt en una superficie cultivable de aproximadamente 61 mil ha, siendo Andalucía la principal productora de tomate seguida de Extremadura. A parte de su interés económico el tomate posee características agronómicas que la convierten en una adecuada planta de experimentación. Algunas de estas características más destacables son: 1) la posibilidad de cultivar tomate en diferentes condiciones, lo que permite comprender la adaptabilidad del tomate a diferentes estreses abióticos, como por ejemplo el estrés salino, 2) su ciclo de vida relativamente corto, 3) su insensibilidad al fotoperíodo, es decir, la capacidad de floración, y posteriormente la producción de semillas independientemente de las condiciones de la duración del día, 4) la facilidad de polinización controlada e hibridación, 5) la simplicidad de su genética con un genoma relativamente pequeño (aproximadamente 900 Mb) y la falta de duplicación de genes, y 6) su capacidad para propagarse asexualmente por injerto, o para regenerar plantas enteras de diferentes partes de la planta (Bergougnoux 2014). Por todo esto, es necesario comprender en profundidad como la salinidad afecta al metabolismo de las plantas y que posibles mecanismos de defensa pueden presentar las plantas. Conociendo esto, se podrán generar y/o seleccionar variedades más tolerantes ante este tipo de estrés. Por ello el objetivo general de la tesis fue conocer mejor el efecto toxico del estrés salino en el metabolismo y la fisiología de dos genotipos de tomate comerciales (Solanum Lycopersicum L.) (Grand Brix y Marmande RAF), con el fin de arrojar una visión global e interconectada de los mismos, atendiendo también a las posibles diferencias genotípicas. El establecimiento de un amplio conocimiento en este sentido podría sentar las bases para la generación o mejora de genotipos más tolerantes/resistentes al estrés salino. Para lograr dichos objetivos se llevaron a cabo experimentos donde se mostró como el efecto toxico del estrés salino afecta a diferentes rutas y procesos metabólicos de los genotipos de tomate seleccionados. Estos experimentos fueron agrupados y divididos en cuatro capítulos, además, dentro de estos capítulos se trató de describir los procesos fisiológicos clave donde podría residir la tolerancia al estrés salino, dejando puertas abiertas para la generación de nuevos genotipos más tolerantes a este tipo de estrés. El capítulo 1 se llevaron a cabo ensayos para comprobar el efecto de la salinidad en la generación de estrés oxidativo en las plantas (como la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS)). Complementariamente, se estudiaron los mecanismos antioxidantes enzimáticos como la superóxido dismutasa (SOD) o la catalasa (CAT) y los no enzimáticos como el ascorbato o el glutatión que poseen las plantas para defenderse ante el estrés oxidativo. Además, en este mismo capítulo se muestra el efecto de la salinidad sobre el perfil fitohormonal y como esta alteración afecta a diferentes rutas y procesos metabólicos. En el capítulo 2 nos centramos en el ciclo de los ácidos tricarboxilicos (TCA), para ello se estudiaron enzimas como la citrato sintasa (CS) o la malato deshidrogenasa (MDH) y compuestos como los ácidos orgánicos malato, citrato y oxalacetato. Este ciclo es de vital importancia para las plantas y entre otras cosas genera energía, poder reductor, ácidos orgánicos y precursores de aminoácidos (Aa). En el capítulo 3 se estudiaron compuestos osmoprotectores como la prolina o la glicina betaina (GB), estos compuestos protegen las estructuras celulares y los procesos metabólicos del estrés oxidativo generado por el estrés salino. Para comprender mejor el proceso que rodea a estos compuestos se estudiaron sus enzimas de síntesis como la pirrolina-5-carboxilato sintasa (P5CS) o la betaina aldehído deshidrogenasa (BADH) y enzimas para su degradación como la prolina deshidrogenasa (PDH). Por último, en el capítulo 4 estudiamos uno de los procesos metabólicos mas importantes para las plantas, la asimilación del nitrógeno (N), este genera compuestos nitrogenados esenciales para las plantas. En este capítulo nos centramos en procesos como la principal vía de asimilación de N (el ciclo glutamina sintetasa (GS)/ glutamato sintasa (GOGAT)) o la fotorrespiración (analizando enzimas como la glioxilato oxidasa (GO) o la glioxilato aminotransferasa (GGAT)). Para evaluar el grado de tolerancia al estrés salino se utilizaron parámetros como la biomasa, la tasa de crecimiento relativa (TCR), o la concentración de Na+. En este sentido, y tal como se describe en el capítulo 1 el genotipo Grand Brix presento mayor tolerancia al estrés salino que el genotipo Marmande RAF, lo que se vio reflejado en la biomasa y la TCR. Ambos parámetros presentaron una menor disminución en el tratamiento salino en el genotipo Grand Brix. Sin embargo, la concentración de Na+ fue mayor en este genotipo. En el capítulo 2 se describe como el genotipo Grand Brix pudiera estar compartimentalizando el exceso de Na+ en las vacuolas como oxalato-Na+, evitando de esta forma su efecto citotóxico. Aunque ambos genotipos sobrevivieron al efecto toxico del estrés salino, estos presentaron algunas alteraciones en su metabolismo. A lo largo de la presente tesis doctoral se desarrollará con detalle como algunas de estas alteraciones podrían mejorar la tolerancia al estrés salino y como otras son consecuencia del efecto toxico de este estrés. Bajo condiciones de estrés salino la generación de ROS y el perfil fitohormonal se ven alterados, y estos a su vez interfieren en el metabolismo de la planta. Es por esto que en el capítulo 1 se describe con más detalle la influencia del estrés oxidativo y las fitohormonas sobre el metabolismo de las plantas. Grand Brix mostró niveles más bajos de las principales especies reactivas de oxígeno (ROS) (O2- y H2O2) y de indicadores de daño oxidativo como el malondialdehido (MDA), lo que pudo favorecer que los procesos metabólicos y estructuras celulares estuvieran menos afectadas mejorando la tolerancia al estrés salino de forma directa e indirecta. No obstante, en los sistemas antioxidantes no hubo una clara diferencia entre genotipos, la SOD fue inducida de forma similar bajo estrés salino para ambos genotipos, mientras que la CAT mostró un mayor incremento en Marmande RAF sin embargo, la concentración de ascorbato fue mayor en Grand Brix. Con respecto a las fitohormonas, uno de los muchos procesos metabólicos en los que tienen influencia es la generación y detoxificación de ROS. Pudimos observar en el genotipo Grand Brix un aumento significativo de algunas fitohormonas como el ácido abscísico (ABA), ácido indolacético (AIA), ácido salicílico SA y una disminución de aminociclopropano carboxílico (ACC), precursor del etileno. Los cambios en la concentración de estas fitohormonas podrían estar generando una mayor tolerancia al estrés salino en este genotipo, ya que estas fitohormonas regulan procesos como el desarrollo y crecimiento de las plantas, la senescencia o el cierre estomático, además de favorecer el aumento de la actividad de algunas enzimas como las enzimas para la asimilación del N. Otro proceso metabólico de gran importancia para las plantas es el ciclo TCA, ya que interviene en la producción de energía, ácidos organicos y formación de precursores para la formación de aminoácidos (Aa). En condiciones de estrés salino los ácidos orgánicos generados en este ciclo mejoran los desbalances osmóticos provocados por los iones Na+ y Cl- y previenen el daño oxidativo. Por ello en el capítulo 2 se estudió el efecto toxico de la salinidad sobre este proceso metabólico. En nuestro estudio el efecto toxico del estrés salino fue menos perjudicial en el genotipo Grand Brix, el cual mostró un incremento de todas las actividades enzimáticas que intervienen en este ciclo y de las concentraciones de los ácidos orgánicos malato y citrato. Esto podría ayudar al mantenimiento energético y mejorar el estrés osmotico, procesos que podrían ser clave en la tolerancia a la salinidad. Por otro lado, una mayor actividad enzimática del ciclo TCA podría estar proporcionando precursores para la asimilación de N en Grand Brix como el α-cetoglutarato (α-KG). Las rutas metabólicas para la generación de prolina y GB han sido también estudiadas por su implicación en la tolerancia ante estreses abióticos como el estrés salino. Esto es debido a que estos compuestos ayudan a la prevención del estrés osmotico en plantas, contrarrestando el efecto citotóxico de algunos iones como el Na+ y el Cl- en el caso del estrés salino. Por ello, en el capítulo 3 se describe el efecto de la prolina y la GB sobre la tolerancia a la salinidad. En este caso ambos genotipos acumularon prolina bajo condiciones de estrés salino. Sin embargo, la vía de acumulación de este Aa fue por diferente en ambos genotipos. Pudimos observar que la vía principal de síntesis de prolina (P5CS) no presentó un incremento significativo en ambos genotipos, lo que no se corresponde con la acumulación de prolina que si pudimos observar en los mismos. En este sentido, en el genotipo Grand Brix se observó el incremento de la enzima Ornitina-δ-aminotransferasa (OAT), la cual es una vía secundaria para la generación de prolina que podría verse favorecida en plantas bajo estrés abiótico como el estrés salino. Por otro lado, la principal enzima para la degradación de prolina (PDH) presento una disminución de su actividad para ambos genotipos, sin embargo, esta reducción fue menor en el genotipo Marmande RAF degradándose así mas prolina en este genotipo. Por tanto, la acumulación de prolina en el genotipo Grand Brix viene proporcionada por una síntesis a través de esta vía secundaria y una menor actividad de la PDH, mientras que en el genotipo Marmande RAF la acumulación de prolina podría estar generada por una degradación proteica a consecuencia del estrés salino. En el capítulo 4 se estudió el efecto toxico de la salinidad sobre la asimilación del N, uno de los procesos metabólicos principales en las plantas, ya que genera compuestos nitrogenados, como los Aa, esenciales para el crecimiento y desarrollo de las plantas. Una mejora en la actividad enzimática de la ruta de asimilación de N mejoraría la tolerancia al estrés salino. La ruta de asimilación de N genera precursores/sustratos para otras rutas o procesos metabólicos como oxalacetato para el ciclo TCA o glutamato para la síntesis de prolina, mejorando no solo la biosíntesis de proteínas sino la de compuestos osmoprotectores, energía en forma de ATP y poder reductor. En líneas generales el efecto toxico del estrés salino provoco una disminución de las actividades enzimáticas del genotipo Marmande RAF, tanto en el ciclo GS/GOGAT (principal ruta de asimilación del N) como en la fotorrespiración, disminuyendo la tasa de asimilación de N y obteniendo una menor concentración de N total en la planta. En líneas generales el genotipo Grand Brix presentó una menor concentración de los principales ROS, una menor concentración de MDA y un mejor perfil fitohormonal, lo que favorece que los procesos metabólicos no se vean tan afectados por el estrés salino. Además, Grand Brix presento una mayor actividad de las enzimas implicadas en el ciclo TCA generando así más energía y poder reductor los cuales serán usados en diferentes procesos metabólicos (como la asimilación del N o la generación de compuestos osmoprotectores) manteniendo el correcto crecimiento y desarrollo de las plantas. Por otro lado, el estrés osmotico provoca alteraciones como la degradación de proteínas, proceso que se da con frecuencia en plantas sometidas a estrés. En este sentido, compuestos osmoprotectores como los ácidos orgánicos y la prolina podrían reducir la tasa de degradación proteica. Por último, una mayor actividad para las principales enzimas de asimilación de N proporcionaría una constante tasa de generación de proteínas lo cual es fundamental para el correcto desarrollo de las plantas. En definitiva, la comprensión del metabolismo de la planta, como se interrelacionan los procesos metabólicos y como estos pueden mejorar la tolerancia al estrés salino es fundamental para poder generar genotipos más resistentes a dicho estrés. En este trabajo de tesis doctoral se ha avanzado en este conocimiento, mostrando una visión global de los procesos metabólicos estudiados en ambos genotipos, dejando abiertas líneas de trabajo para la generación de genotipos más resistentes. Las conclusiones de esta tesis doctoral fueron: La reducción de los principales ROS (O2- y H2O2) en Grand Brix mejoró la tolerancia al estrés salino reflejando un menor daño oxidativo (MDA). Las principales vías de detoxificación de estos ROS fueron mediante la GSHPX y compuestos antioxidantes como el AsA. Esto unido a un aumento de la concentración de las fitohormonas ABA, AIA, SA y una disminucion de ACC aumentó el grado de tolerancia al estrés salino de Grand Brix. El genotipo Grand Brix presentó una mayor actividad de las principales enzimas del ciclo TCA, esto proporciona más energía y poder reductor para procesos metabólicos como la asimilación de N, esto unido a una mayor acumulación de ácidos orgánicos que mejora la estabilidad osmótica en las células mejorará la tolerancia al estrés salino. Por otro lado, el ácido orgánico oxalato puede estar reduciendo, en Grand Brix, el efecto fitotóxico del Na+ por compartimentalización en las vacuolas y/o apoplasto. La vía secundaria para la síntesis de prolina, a través de la enzima OAT, podría ser una ruta a tener en cuenta en la tolerancia a la salinidad. Esto unido a una menor inducción de la PDH en Grand Brix podría estar generando una mayor acumulación de prolina y por tanto una mayor tolerancia a la salinidad Una mayor actividad para las principales enzimas de asimilación de N, como el ciclo GS/GOGAT, en plantas bajo estrés salino proporciona una constante tasa de generación de Aa y proteínas, además de precursores para otras rutas metabólicas, compuestos fundamental para el correcto desarrollo y crecimiento de las plantas, mejorando de esta forma la tolerancia al estrés salino. La variabilidad genotípica incluso en genotipos comerciales influye en el grado de tolerancia/resistencia al estrés salino, siendo en nuestro caso el genotipo Grand Brix más tolerante a la salinidad que el genotipo Marmande RAF.