Estudio de la biodisponibilidad y alteraciones metabólicas y del estado oxidativo ocasionadas por la exposición a nanopartículas de oro

  1. López Chaves, Carlos
Supervised by:
  1. Cristina Sánchez González Director
  2. Jörg Bettmer Director

Defence university: Universidad de Granada

Fecha de defensa: 11 May 2018

Committee:
  1. José Luis Quiles Morales Chair
  2. Raquel Durán Ogalla Secretary
  3. Elisa Blanco González Committee member
  4. José Garrido Mesa Committee member
  5. Javier Santos Burgos Muñoz Committee member
Department:
  1. FISIOLOGÍA

Type: Thesis

Abstract

INTRODUCCIÓN El uso de nanomateriales (material natural o manufacturado que contiene partículas individuales o en estado de agregación o aglomeración, y donde al menos el 50% de las nanopartículas presentan una o más dimensiones en el rango de 1 a 100 nm),1 ha crecido exponencialmente en las últimas décadas gracias a sus propiedades fisicoquímicas únicas tales como gran área superficial, tamaño, forma o carga. Así, la nanotecnología (definida como el diseño, síntesis y aplicación de materiales y dispositivos cuyo tamaño y forma ha sido diseñado en la nanoescala), es reconocido como uno de los campos más emergentes en el ámbito científico. En este sentido, el desarrollo de productos con nanomateriales alcanza casi todos los áreas. Por ejemplo, productos electrónicos,2,3 textiles,4,5 cosméticos o diferentes materiales de construcción6 han sido diseñados con nanocomponentes que les permiten almacenar información en espacios más pequeños, repeler aceite o agua, absorber luz ultravioleta o aumentar su resistencia. 2 Entre las distintas áreas, la biomedicina se ha beneficiado enormemente de estos nanomateriales. Como referencia, técnicas de imagen como la resonancia magnética,7,8 tomografía computerizada o tomografía de emisión de positrones;9,10 sistemas de detección como la fotoluminiscencia o la resonancia de plasmón superficial han mejorado considerablemente debido al uso de nanomateriales. Además, la nanotecnología en biomedicina ha permitido desarrollar novedosas terapias en el tratamiento de diferentes patologías como el cáncer, la diabetes o el Parkinson.11–14 Junto con las principales propiedades de los nanomateriales previamente descritas, el oro posee una serie de atributos inherentes que hacen de sus nanoestructuras una plataforma atractiva para diversos ámbitos, incluyendo las aplicaciones biomédicas: resistencia contra la oxidación y corrosión, toxicidad más baja, buen rango de coordinación, etc.15–17 No obstante, y pese a los amplios beneficios de los nanomateriales en biomedicina e industria, la nanotoxicología ha nacido como un nuevo campo de estudio en un intento de dar respuesta al interés de conocer los posibles efectos secundarios que las nanoestructuras pueden ocasionar en los sistemas biológicos y cómo esos efectos podrían ser mitigados. OBJETIVOS El principal objetivo de la presente tesis doctoral será estudiar las alteraciones metabólicas derivadas de la exposición a nanopartículas de oro, así como su biodistribución y repercusión en el estado oxidativo.18 MATERIALES & MÉTODOS Para los estudios in vitro e in vivo se utilizaron nanopartículas de oro estabilizadas con citrato de 10, 30 y 60 nm; suspendidas en agua ultrapura en una concentración de 50 mg·L-1. In vitro: para los estudios con células, se emplearon las líneas de carcinoma hepatocelular (Hep G2) y carcinoma colorectal (HT-29). Éstas fueron expuestas a las nanopartículas en concentraciones de 10 μg·kg-1 o 10 mg·kg-1 durante 16 o 32 horas para determinar la viabilidad celular y la producción de especies reactivas de oxígeno. 3 Además, se empleó el ensayo del cometa para evaluar las posibles roturas en ADN. Para ello se trataron los células Hep G2 con 10 mg·kg-1 de nanopartículas de oro durante 16 horas. Finalmente, la línea celular HT-29 fue utilizada para llevar a cabo un estudio longitudinal que determinase la localización intracelular de estos nanomateriales mediante microscopía electrónica de transmisión. Estas células fueron tratadas con 10 mg·kg-1 de dichas nanopartículas durante 2, 4 o 16 horas. In vivo: ratas macho Wistar con un peso inicial de 190-220 g fueron divididas en 4 grupos: Grupo control: ocho ratas que fueron inyectadas con 0.4 mL de agua ultrapura por día. Grupo AuC 10: ocho ratas que fueron inyectadas con 0.4 mL de nanopartículas de 10 nm por día. Grupo AuC 30: ocho ratas que fueron inyectadas con 0.4 mL de nanopartículas de 30 nm por día. Grupo AuC 60: ocho ratas que fueron inyectadas con 0.4 mL de nanopartículas de 60 nm por día. En todos los casos, la administración fue intraperitoneal. El día 9, los animales fueron sacrificados y la sangre fue recogida para determinar los diferentes parámetros hematológicos y posteriormente centrifugada para separar el suero. El hígado, riñón, bazo, encéfalo, pulmones, testículos, fémur, corazón, intestino y músculo gastronemio se extrajeron para determinar el contenido en oro mediante ICP-MS. El hígado también se empleó para evaluar la peroxidación lipídica y la carbonilación proteica (mediante la medición de los niveles de TBARS y de los grupos carbonilo); así como el estado inflamatorio (tras cuantificar los valores de TNF-, IL-1ß, IL-6 e IL-10) y la localización intracelular de las nanopartículas mediante TEM. Finalmente, se determinaron algunos parámetros bioquímicos en suero como glucosa, urea, ácido úrico, triglicéridos, albúmina, colesterol, gamma glutamil transpeptidasa, fosfatasa alcalina, GOT y GPT. RESULTADOS & DISCUSIÓN In vitro: Se observó un descenso proporcional en la viabilidad celular a medida que la producción en ROS aumentaba. Estos parámetros mostraron una relación dosis y tiempo dependiente, exhibiendo mayor daño a 16 horas y con una dosis de nanopartículas de 10 mg·kg-1 . En nuestra opinión, las células son capaces de controlar la sobreproducción de ROS tras 32 horas de exposición, probablemente gracias al 4 incremento en la actividad antioxidante; lo que permite restaurar el índice de viabilidad celular. Además, el estudio del ensayo del cometa probó que las nanopartículas de oro inducen roturas en el ADN de una manera tamaño dependiente. De hecho, las nanopartículas de 10 nm provocaron un daño similar al encontrado en las células control positivas; mientras que las nanopartículas de 60 nm no afectaron a la integridad del DNA. Teniendo en cuenta que el diámetro efectivo del poro del núcleo es alrededor de 35 nm, es probable que las nanopartículas de 10 y 30 nm pudieron acceder al núcleo, favoreciendo por tanto las roturas de DNA mediante la producción de ROS. Este hecho fue posteriormente confirmado mediante las imágenes de TEM, que revelaron la presencia de nanopartículas de oro de 10 nm en el núcleo tras 16 horas de exposición. Adicionalmente, este estudio longitudinal demostró la variación de la localización celular de estos nanomateriales a lo largo del tiempo. De hecho, las nanoestructuras fueron encontradas principalmente como partículas individuales por el citosol tras 2 y 4 horas; mientras que la mayoría de ellas fueron gradualmente digeridas y almacenadas en el interior de gotas lipídicas; probablemente en un intento de neutralizar y reducir su toxicidad en el interior celular. In vivo: en concordancia con lo establecido en los cultivos celulares, la exposición a nanopartículas de oro provocó un daño en los componentes lipídicos y proteicos celulares, como atestiguan los incrementos en los niveles de TBARS y grupos carbonilo. El hecho de que los lípidos y proteínas no se encuentran en una zona restringida mediante una membrana dentro de la célula, podría explicar la ausencia de diferencias significativas entre las ratas tratadas. El estudio de la concentración de oro en los diferentes órganos, mostró una distribución desigual. El hígado, riñón e intestino presentan el mismo patrón, donde las nanopartículas de 10 y 30 nm se acumularon en mayor medida que las de 60 nm, que tendieron a almacenarse en bazo. En nuestra opinión, las nanopartículas más grandes fueron rápidamente eliminadas de la sangre mediante el sistema reticuloendotelial y así se acumularon en hígado y bazo. Dado que su diámetro es mayor al necesario para poder filtrarse mediante el riñón, su excreción mediante la orina fue bloqueada, como acreditan los bajos niveles de oro en orina. En este sentido, los elevados valores de concentración de oro en intestino de las nanopartículas de 10 y 30 nm, junto con el 5 incremento en el contenido de este elemento en heces; y teniendo en cuenta que la vía de administración fue intraperitoneal (no enteral), consideramos que la principal ruta de eliminación endógena de las nanopartículas más pequeñas es la fecal. Otros órganos como el músculo, corazón o hueso también parecen ser importantes órganos de almacenamiento de estos nanocompuestos, aunque en menor medida a tenor de las concentraciones de oro encontradas en estos tejidos. La administración de las nanopartículas afectó la correcta función de la médula ósea, como demuestran los valores bajos de hemoglobina corpuscular media, concentración media de hemoglobina corpuscular y hematocrito; lo que definitivamente define una anemia incipiente. En relación con los parámetros bioquímicos e inflamatorios, no se observaron cambios significativos entre los diferentes grupos. Bajo nuestro punto de vista, si bien la exposición a nanopartículas de oro induce un incremento en la producción de ROS que afecta a la integridad de los componentes celulares y provoca una anemia inicial, estos daños fueron insuficientes para disparar una respuesta inflamatoria o bioquímica. CONCLUSIONES Los resultados obtenidos nos permiten concluir que el tamaño de las nanopartículas determina sus destinos metabólicos y la formación de depósitos en los diferentes sistemas biológicos. El diámetro de las nanopartículas también determina su ruta de eliminación, siendo la principal vía de eliminación de las nanopartículas más grandes el sistema reticuloendotelial del bazo, y la vía endógena intestinal la principal ruta de excreción de las nanoestructuras con menor tamaño. Además, hemos probado que las nanopartículas de oro provocan un desequilibrio en el estado oxidativo de las células, lo que consecuentemente causa un daño en las estructuras proteicas, lipídicas y genéticas. Estas alteraciones presentaron una clara dependencia del tamaño, ya que las nanopartículas de 10 nm mostraron mayores daños, detectados por su localización nuclear y su mayores roturas de ADN. El tratamiento con nanopartículas de oro también afectó la función normal de la médula ósea y se observó una anemia incipiente. A pesar de estos efectos dañinos, no se alteró el estado inflamatorio ni se determinaron daños tisulares tras este periodo de exposición.