Preclinical studies for the gene therapy of leukocyte adhesion deficiency type i

Resumen

La Deficiencia de Adhesión Leucocitaria Tipo I (DAL-I) es una inmunodeficiencia primaria producida por mutaciones en el gen ITGB2, que codifica para la proteína CD18 o subunidad ß2. Esta proteína se asocia con diferentes subunidades CD11 para formar las integrinas ß2, las cuales se expresan en la membrana de los leucocitos y les permiten adherirse al endotelio como paso previo a la extravasación. Las mutaciones en el gen ITGB2 producen una reducida, ausente o aberrante expresión de CD18, lo que se traduce en la ausencia de integrinas ß2 en la membrana leucocitaria. Los leucocitos de estos pacientes, principalmente los neutrófilos, son incapaces de abandonar el torrente sanguíneo y combatir las infecciones que se producen en los diferentes tejidos. Así, estos pacientes sufren infecciones bacterianas graves y recurrentes que pueden conducir a su muerte. En la presente tesis doctoral nos propusimos inicialmente caracterizar una cepa de ratón que presenta una mutación hipomórfica en el gen itgb2 (CD18HYP) para su posterior uso como modelo animal de DAL-I. Estos ratones mostraban una expresión baja pero detectable de integrinas ß2 en células linfoides y mieloides y presentaban leucocitosis y defectos en la migración de neutrófilos en respuesta a agentes inflamatorios. Sorprendentemente, la médula ósea (MO) de estos ratones presentaba un mayor contenido de células madre hematopoyéticas (CMHs). Además, las células de MO de los ratones CD18HYP presentaban una mayor capacidad de repoblación competitiva que las de un ratón WT. A través de diferentes experimentos in vivo observamos que la ausencia de CD18 conduce a la expansión del compartimento de CMHs incluso en presencia de un ambiente hematopoyético WT, lo que demuestra por primera vez el papel de CD18 en la regulación del nicho hematopoyético. Al tratarse de una enfermedad hematopoyética monogénica, DAL-I es una enfermedad idónea para ser tratada mediante terapia génica (TG) ex vivo. Por ello, generamos cuatro vectores lentivirales (VLs) autoinactivantes en los que la expresión del gen ITGB2 está controlada por diferentes promotores, tanto ubicuos (PGK y UCOE) como mieloides (Chim y MIM). Estos VLs demostraron su eficacia para recuperar la expresión de integrinas ß2 y corregir el fenotipo en dos modelos in vitro: una línea linfoblastoide derivada de un paciente con DAL-I y CMHs sanas interferidas para la expresión de CD18 (mediante la utilización de un VL que expresa un RNAsh capaz de reconocer el RNAm de CD18). Finalmente, pasamos a realizar experimentos de TG ex vivo en los ratones CD18HYP. Los ratones tratados por TG presentaban células en sangre periférica y en MO que expresaban la proteína humana CD18 (hCD18). Además, estas células presentaban una mayor expresión de la proteína endógena CD11a (mCD11a) en comparación con ratones no tratados, lo que indicaba que la expresión ectópica de hCD18 rescataba la expresión de las integrinas ß2 de ratón. La expresión de hCD18 en todos los grupos tratados siempre fue mayor en neutrófilos que en linfocitos, aunque fueron aquellos ratones tratados con el vector LV:Chim.hCD18 en los que el ratio entre la expresión mieloide y la expresión linfoide fue mayor. Al retransplantar la MO de estos ratones, se observaron células hCD18+ con expresión incrementada de mCD11a en los receptores secundarios, lo que indicaba que los VLs-hCD18 eran capaces de transducir CMHs con capacidad de repoblación a largo plazo. La recuperación de valores normales de leucocitos en la sangre y el restablecimiento de la capacidad de extravasación de los neutrófilos corroboraron la eficacia terapéutica de estos vectores. Aunque se obtuvieron resultados muy similares con todos los VLs, el promotor ideal para la TG de DAL-I sería aquel que expresase hCD18 en todas las células hematopoyéticas y que dirija una alta expresión en el linaje mieloide, puesto que es el tipo celular más afectado por la deficiencia en esta proteína. Por eso, y en base a los resultados obtenidos, proponemos el uso del vector LV.Chim.hCD18 para un futuro ensayo de terapia génica en pacientes con DAL-I. Leukocyte Adhesion Deficiency Type I (LAD-I) is a primary immunodeficiency caused by mutations in ITGB2 gene, encoding for CD18 protein (also known as ß2 subunit). This protein binds to different CD11 subunits to form ß2 integrins, which are expressed in the leukocyte membrane and allow leukocytes to firmly adhere to the endothelium as a previous step to the extravasation. In LAD-I patients, ITGB2 mutations lead to absent, low or aberrant CD18 expression, which results in absent or low ß2 integrin expression on the leukocyte membrane. CD18 deficient leukocytes, especially neutrophils, fail to extravasate from the bloodstream to infected tissues. LAD-I patients suffer from recurrent and severe infections leading normally to death. In the present doctoral thesis, we initially aimed to characterize a mouse strain presenting an hypomorphic mutation in the itgb2 gene (CD18HYP), which would be later used as a LAD-I animal model. These mice displayed low but still present ß2 integrin expression in lymphoid and myeloid cells and showed leukocytosis and defects in neutrophil extravasation capacity in response to different inflammatory stimuli. Surprisingly, CD18HYP bone marrow (BM) showed enrichment in haematopoietic stem cells (HSCs). Moreover, BM cells from CD18HYP mice presented a higher competitive repopulation ability compared to WT cells. Through different in vivo experiments, we demonstrated that CD18 deficiency lead to the expansion of HSCs even in the presence of a WT haematopoietic environment, which pointed out the role of CD18 in the regulation of the haematopoietic niche for the first time. As a monogenic haematopoietic disorder, LAD-I is a good candidate for ex vivo haematopoietic gene therapy (GT). For this, we generated four lentiviral vectors (LVs) in which ITGB2 gene is expressed under ubiquitous (UCOE and PGK) or myeloid (Chim and MIM) promoters. These LVs succeeded in the CD18 expression and phenotype restoration in two different in vitro models: a lymphoblastic cell line derived from a LAD-I patient and in CD18-interferred healthy HSCs (generated by the use of a LV expressing a shRNA against the CD18 mRNA). Finally, we carried our GT experiments in CD18HYP mice. GT-treated CD18HYP mice showed peripheral blood and BM cells expressing hCD18 protein, which in addition showed higher expression of mCD11a subunit in comparison with untreated mice. This indicated that ectopic hCD18 expression restores murine ß2 integrins. hCD18 expression was always higher in myeloid than in lymphoid cells in all treated groups, although LV.Chim.hCD18-treated animals showed the highest ratio between myeloid and lymphoid expression. When BM from these animals was re-transplanted into secondary recipients, hCD18+ cells with increased mCD11a expression could be observed, indicating that all CD18-LVs were able to transduce true and long-term HSCs. The recovery of normal number of leukocytes and the reestablishment of inflammation-mediated neutrophil extravasation capacity supported the therapeutic effect of these LVs Although similar results were obtained with all the hCD18-LVs, the ideal promoter for the GT of LAD-I would be the one driving a high expression of CD18 in the myeloid lineage but also expressing at a low level in other haematopoietic cells. For this reason, and on the basis of these results, we propose the use of LV.Chim.hCD18 for a future LAD-I GT clinical trial.