Caracterización de la secuencia pr77 con función dual promotor-ribozima en el elemento móvil l1tc de trypanosoma cruzi. Análisis de la interacción de las actividades transcriptasa inversa y chaperona de ácidos nucleicos de l1tc
- MACIAS HUETE, FRANCISCO
- M. Carmen Thomas Carazo Director/a
Universitat de defensa: Universidad de Granada
Fecha de defensa: 25 de de gener de 2013
- Vicente Larraga Rodríguez de Vera President/a
- Antonio Sánchez Pozo Secretari
- José M. Requena Rolanía Vocal
- Enrique Martínez Carretero Vocal
- José Luis Moreno Frigols Vocal
Tipus: Tesi
Resum
Los elementos móviles son fragmentos de DNA con capacidad de movilizarse a través del genoma de la célula que los alberga, existiendo un alto porcentaje de ellos en los genomas de eucariotas y procariotas (Thomas et al. 2010). En humanos, las inserciones de elementos móviles se han relacionado con la aparición de procesos patológicos, especialmente de tipo tumoral. En tripanosomátidos, la gran densidad de elementos móviles dispersos en el genoma, principalmente retrotransposones de tipo sin-LTR, se ha relacionado con procesos de reparación cromosómica, reorganización, expresión y regulación génica, así como variabilidad evolutiva, aportando a dichos organismos una gran plasticidad genómica. La mayoría de estos elementos presentan conservada una secuencia de 77-79 nucleótidos en su extremo 5¿ la cual se conoce como huella Pr77-79. Esta secuencia es capaz de activar la transcripción generando transcritos traducibles (Heras et al. 2007). El elemento móvil L1Tc, objeto de estudio en esta tesis, es un retrotransposón LINE autónomo presente en el genoma de Trypanosoma cruzi. Este elemento presenta un tamaño de unas 5kb, se encuentra flanqueado por secuencias de duplicación directa y contiene una cola de poliadenilación en su extremo 3¿ (Martín et al. 1995). L1Tc presenta un único marco abierto de lectura que codifica para las actividades: endonucleasa (Olivares et al. 1997 y 1999), transcriptasa inversa (Garcia-Pérez et al. 2003), RNasaH (Olivares, Garcia-Pérez et al. 2002) y chaperona de ácidos nucleicos (Heras et al. 2005 y 2009). Además, corriente arriba del dominio endonucleasa, L1Tc codifica para una secuencia catalítica de tipo 2A similar a las presentes en ciertos picornavirus (Heras et al. 2006). En la región 5¿UTR del elemento, concretamente en los primeros 77 nucleótidos (correspondientes a la huella Pr77-79), el elemento contiene un promotor denominado Pr77 (Heras et al. 2007). De forma interesante, en el transcrito correspondiente al elemento, esta región conforma una ribozima de tipo HDV denominada L1TcRz la cual lleva a cabo un corte co-transcripcional en el RNA del elemento (Sanchez-Luque et al. 2011). Así pues, los primeros 77 nucleótidos del elemento L1Tc, a nivel de DNA y RNA, constituyen un sistema funcional dual promotor-ribozima (Pr77-L1TcRz) el cual puede tener implicaciones, no solo sobre la biología del elemento L1Tc, sino también en procesos de expresión y regulación de otros genes del parásito (Sanchez-Luque et al. 2012). En la presente tesis, hemos identificado un motivo o core promoter element en la secuencia promotora Pr77, similar a los presentes en regiones promotoras asociadas a retrotransposones y genes implicados en desarrollo de insectos que carecen de caja TATA o ésta no es funcional. Este motivo presenta el consenso CGTG en las posiciones +25 a +28 relativo al nucleótido +1, previamente establecido en el laboratorio como inicio de la transcripción (Heras et al. 2007). Mediante ensayos de transfección de parásitos con construcciones consistentes en un gen reportero bajo el control transcripcional de una serie de secuencias mutadas derivadas de Pr77, hemos demostrado que este motivo está implicado, junto a otras regiones de la secuencia promotora Pr77, en la transcripción de dicho reportero. Principalmente, mutaciones dirigidas hacia regiones altamente conservadas en las secuencias Pr77-79 presentes en tripanosomátidos anulan la capacidad transcripcional de dicha secuencia. Mediante ensayos de RT-PCR hemos demostrado que los transcritos derivados de las secuencias mutadas de Pr77 carecen de spliced leader. Además, mediante ensayos de retardo en gel, se ha evidenciado la unión específica de proteínas nucleares de T. cruzi a la secuencia Pr77, como posibles factores de transcripción. Estas proteínas presentan una unión preferencial frente a la región altamente conservada en Pr77-79 de tripanosomátidos, la cual contiene el core promoter element y donde, tanto la secuencia como la estructura en el DNA juegan un papel relevante. Así mismo, hemos identificado a nivel de nucleótido regiones de la secuencia Pr77 implicadas en la actividad de corte de la ribozima presente en dicha secuencia, denominada L1TcRz, concluyendo que existen regiones/nucleótidos que afectan de forma desigual a las actividades promotora y ribozima. Además, hemos demostrado que la ribozima L1TcRz es activa in vivo mediante ensayos de extensión de primer. NARTc (0,26kDa) es un elemento no autónomo que coexiste en el genoma de T. cruzi junto a L1Tc (Bringaud et al. 2002). Los mRNAs de estos elementos mantienen conservada una secuencia la cual puede estar implicada en la movilización de los mismos al mediar la unión de la maquinaria enzimática del elemento autónomo. Mediante ensayos de retardo en gel, hemos demostrado que las proteínas codificadas por el elemento L1Tc: C2L1Tc y RTL1Tc (con actividades chaperona de ácidos nucleicos y transcriptasa inversa, respectivamente) presentan una preferencia de unión por esta secuencia. RTL1Tc presenta una mayor afinidad por la secuencia compartida entre los elementos L1Tc y NARTc, donde el extremo carboxilo de dicha proteína juega un papel importante en la capacidad de unión. Por otro lado, hemos determinado que C2L1Tc une un RNA que contiene a dicha secuencia siguiendo un patrón altamente cooperativo. Estos hechos podrían sugerir que estas dos proteínas están implicadas en la formación de la ribonucleopartícula del elemento L1Tc. Además, mediante ensayos de extensión de primer, hemos demostrado que la proteína recombinante C2L1Tc asiste a la función transcriptasa inversa de la proteína RTL1Tc favoreciendo el proceso de reverso-transcripción sobre moldes de RNA. Este hecho podría deberse a los reordenamientos que esta proteína produce en los ácidos nucleicos, relajando estructuras adoptadas por el RNA. Finalmente, mediante un análisis in silico de carácter predictivo, hemos mostrado sobre la secuencia deducida de aminoácidos del elemento L1Tc, la posible presencia de dos dominios proteolíticos de tipo 3C, similares a los presentes en ciertos picornavirus. Mediante ensayos de transcripción-traducción in vitro en reticulocitos de conejo, hemos detectado bandas de un tamaño consistente con aquellas que el procesamiento por estos dos dominios teóricamente originarían. Sin embargo, no se detectó procesamiento en ensayos preliminares in vivo llevados a cabo mediante transfección de formas epimastigotes de T. cruzi con una serie de construcciones que contienen los hipotéticos dominios 3C flanqueados por genes reporteros heterólogos al elemento.