Soportes tridimensionales biodegradables basados en micropartículas para la regeneración del cartílago articular

Resumen

Introducción El cartílago es una estructura viscoelástica, hipocelular, aneural, alinfático y avascular. Su función en el organismo consiste en el soporte y distribución de carga, soportando cerca de 10 millones ciclos carga/año. Gracias a sus propiedades biomecánicas, permite un movimiento casi libre de fricción al disminuir el coeficiente de rozamiento. Es por tanto de vital importancia para la correcta congruencia y función articular. Las lesiones cartilaginosas poseen escasa capacidad de regeneración, siendo uno de los condicionantes la naturaleza avascular del tejido. Según el diámetro y profundidad de la lesión, el tejido podrá tratar de suplirla de una manera u otra. Si la lesión no altera la superficie articular, las células viables y la neosíntesis de matriz permitirá una reestructuración del tejido. Sin embargo, ante fracturas o roturas condrales y osteocondrales, en la mayoría de casos la tendencia será hacia la formación de un tejido fibroso y la degeneración articular. La etiología de estas lesiones variará desde la propia degeneración articular, pasando por causas infecciosas como la artritis séptica, enfermedades de depósito como la condrocalcinosis, otras causas no traumáticas como la osteocondritis disecante y la necrosis condilar, y finalmente los traumatismos articulares. La clasificación más comúnmente utilizada para de dichas lesiones es la de Outerbridge, que las divide según su profundidad en grado 0 (cartílago normal), grado I para un adelgazamiento o reblandecimiento cartilaginoso, grado II para el desflecamiento o fisura superficial que afecta a menos del 50% del grosor, el grado III que englobará fisuras profundas que afectan a más del 50% del grosor cartilaginoso, y finalmente el grado IV con lesiones del espesor completo y exposición ósea. De cara a plantear el tratamiento de pacientes de mayor edad, con menor exigencia funcional y con lesiones de menor tamaño, se podrá optar por un tratamiento ortopédico limitando la carga hasta lograr la mejoría. Otra de las opciones terapéuticas es el desbridamiento de las lesiones mediante artroscopia. En ella se realizará, durante un tiempo quirúrgico artroscópico, la exéresis de fragmentos desflecados y la regularización de la superficie articular, permitiendo también un diagnóstico más preciso de la extensión y gravedad de las lesiones, evaluando la necesidad de asociar otros enfoques terapéuticos. Este tratamiento estaría indicado en pacientes con baja demanda funcional que presenten lesiones condrales Outerbrigde I-II y asocien síntomas meniscales. No obstante, los resultados a medio y largo plazo son mediocres, existiendo una necesidad de nuevos tratamientos en torno al 50% a los 3 años. Una alternativa es la estimulación de la médula ósea subyacente, bien sea mediante la condroabrasión o las micro y nanofracturas. Su principio es lograr la migración de células madre mesenquimales que reparen el tejido dañado desde el hueso subcondral hasta la superficie lesional. Poseen una capacidad de éxito limitada para pacientes más jóvenes. La condroabrasión consiste en una limpieza quirúrgica de la lesión superficial condral, fue una técnica muy usada en la década de los 80, cuya indicación original era paliativa o de rescate en pacientes con artrosis. Posee como contraindicaciones la inestabilidad y desalineación articular, la obesidad mórbida y la incapacidad para la descarga prolongada. Los resultados no son alentadores de las revisiones realizadas, y si se consulta la literatura se pueden observar autores que constatan hasta 99% de pacientes con limitaciones en la movilidad, y hasta 50% de pacientes que requieren una sustitución protésica de la articulación a los 3 años. En general, si bien existe una disparidad de resultados, no existe aparente beneficio de la condroabrasión. Las microfracturas son otra opción cuya base consiste en realizar perforaciones en la zona lesional lo suficientemente profundas como para que lleguen a penetrar en la zona de hueso subcondral, permitiendo así la migración de células pluripotenciales desde la médula ósea subyacente mediante la formación de un coágulo mesenquimal que fomentará la diferenciación a estructuras cartilaginosas que reparen el tejido dañado. Estarán indicadas en pacientes jóvenes con demanda funcional, con IMC<30, una lesión única pequeña identificada durante una artroscopia por otro motivo o bien lesiones sintomáticas menores a 2 cm2 de espesor completo sin lesión subcondral, en zona de carga del femur y tróclea. En un primer lugar se realiza un desbridamiento de la zona de cartílago dañado. Posteriormente, mediante un punzón o aguja de kirschner se producen perforaciones de entre 2 y 4 mm de profundidad, separadas entre sí por 3 o 4 mm. El sangrado desde el lecho subcondral subyacente crea una invasión de la zona lesional por sangre, que formará el citado coágulo. Una vez maduro, este coágulo se diferenciará hasta fibrocartílago, cubriendo así la superficie lesional. Sin embargo, en revisiones sistemáticas de estudios de nivel I y II evaluando los resultados de estas técnicas, la reincorporación al deporte y la satisfacción a medio plazo no es óptima. Encontramos buenos resultados a corto plazo en pacientes jóvenes con lesiones pequeñas (<2cm2), pero con deterioro significativo a partir de los 2 años y mostrando un fracaso independientemente del tamaño de la lesión a partir de los 5 años. Las nanofracturas siguen el mismo principio que las microfracturas, pero se diferencian tanto en el diámetro de la perforación realizada como en su mayor profundidad (una media de 9 mm). También existe la posibilidad de, si la lesión es lo suficientemente grande, realizar una mosaicoplastia: extraer un taco de una zona osteocondral sana del paciente que no sea sometida a carga (un ejemplo típico es las zonas sin contacto articular en el cartílago del fémur distal), para posteriormente encastrarlas en el defecto existente. Esta opción conlleva como desventaja la morbilidad sobre la zona dadora, además de necesitar una combinación de cirugía artroscópica y abierta para su extracción y colocación en la zona lesionada. Estará indicada en lesiones condrales y osteocondrales de pequeño y moderado tamaño (1 a 3 cm2) en cóndilos femorales y la lesiones femoropatelares. Podremos usar esta técnica en pacientes menores de 50 años, con lesiones focales sintomática Outerbridge grado III y IV, con tamaños oscilando entre 1 y 3 cm2, con articulaciones estables y normoalineadas. En estudios realizados en los que se practicaba una segunda artroscopia al año de la reparación, se observó una cobertura con cartílago hialino del 83%, con una morbilidad de la zona de extracción del 3%. De 93 deportistas profesionales, el 64% logró la reincorporación completa, mientras que un 19% tuvo que bajar las exigencias y el nivel deportivo, y un 17% tuvo que suspender la práctica deportiva. Además, en un estudio comparativo entre microfracturas y mosaicoplastias/injerto autólogo osteocondral, se encontró una mayor tasa de retorno al deporte de competición en pacientes jóvenes tratados con injerto 6. De manera similar al injerto autólogo osteocondral, existe la posibilidad de realizar un aloinjerto osteocondral. Los casos en los que plantearemos esta opción serán grandes lesiones traumáticas (>3-4 cm2), en cirugía de salvamento, con lesiones no contenidas de 1 cm o más de profundidad. Aun así, la viabilidad celular de estos aloinjertos es discutible. Otras opciones de más reciente aparición son las técnicas de regeneración, que incluyen el cultivo de condrocitos autólogos para su posterior implementación en las zonas de lesión, bien cubiertas de un parche de periostio como en forma de parche de colágeno (porcino o sintético). Se podrá realizar esta técnica en pacientes entre 15-55 años, con lesiones sintomáticas del total del espesor cartilaginoso (grado III o IV de Outerbridge), con la superficie articular femoral o rotuliana accesible. Como problemática plantean la insuficiente estabilidad de los aportes de cartílago cultivado, la distribución incierta de las células en el defecto, la hipertrofia perióstica perilesional y la delaminación del defecto. La evolución de dicha técnica ha llevado a la asociación previa del cultivo a una matriz para su posterior implantación, mediante la impregnación de los condrocitos autólogos cultivados en una membrana de colágeno I/III y su posterior fijación con fibrina, sutura, o pernos. Estas técnicas, al igual que el injerto autólogo osteocondral, precisan de abordajes combinados abiertos/artroscópicos. Además, estas opciones requieren un primer tiempo de extracción, un tiempo de cultivo y posteriormente una cirugía de implantación. En cuanto al resultado de estas técnicas, los estudios no muestran diferencias clínicas, artroscópica o histológicas a 1 año entre la implantación asistida de matriz o no de las células cultivadas. En la comparación con los injertos autólogos, ofrecen buenos resultados clínicos, pero una menor reincorporación deportiva. En comparación con las microfracturas presenta mejores resultados y una mayor reincorporación al deporte.   Hipótesis No existe un método terapéutico óptimo frente a la regeneración de las lesiones condrales. Con la experiencia que hemos diseñado esperamos conseguir un tejido de regeneración muy similar al cartílago hialino articular nativo en los grupos en los que vamos a utilizar rellenos de biomateriales. Por el contrario en los controles, sin uso de biomateriales, se espera que el tejido de reparación sea de menor calidad, probablemente también de carácter cartilaginoso pero en su variante fibrosa. Esto significaría que existe un avance en cuanto a la posible regeneración del cartílago articular mediante el uso de biomateriales. Éstos podrían implantarse mediante el uso de artroscopia en las lesiones condrales, sin necesidad de cirugía abierta y sin requerir una agresión al tejido donante en una extracción celular como la que se produce para el cultivo de condrocitos, ni el tiempo necesario para él. Dicho proceso ahorraría costes, evitaría la morbilidad de la zona donante (asociada a terapéuticas como la mosaicoplastia y en menor medida en el uso de células madre mesenquimales) y acortaría los tiempos necesarios para el tratamiento. Objetivo principal Esta tesis doctoral trata de evaluar la calidad del cartílago obtenido tras aplicar en lesiones condrales técnicas de Ingeniería Tisular. Se han usado diferentes biomateriales como andamiajes en forma microesferas en un modelo animal, concretamente en conejos New Zealand. Objetivos específicos 1.- Producir lesiones condrales en las superficies articulares de la tróclea femoral de la rodilla del animal de experimentación. 2.- Implantar andamiajes de ácido poliláctico, en forma de microesferas, en las lesiones creadas y cubrir el defecto con una membrana estabilizadora de ácido poliláctico para posteriormente analizar la estructura histológica y cuantificar morfométricamente los neocartílagos obtenidos frente al control nativo contralateral. 3.- Implantar en las lesiones creadas un combinado de microesferas, 50% de ácido poliláctico y 50% de quitosano, y cubrir el defecto con una membrana estabilizadora de ácido poliláctico, para posteriormente analizar la estructura histológica y cuantificar morfométricamente los neocartílagos obtenidos frente al control nativo contralateral. 4- Labrar el defecto articular sin rellenar de biomaterial, únicamente cubriéndolo con la membrana estabilizadora de ácido poliláctico en un grupo tomado como control para posteriormente analizar la estructura histológica y cuantificar morfométricamente los neocartílagos obtenidos frente al control nativo contralateral. 5.- Realizar un análisis estadístico de los resultados obtenidos, de cara a comprobar en términos objetivables la calidad del tejido obtenido y la capacidad de regeneración de esos defectos por parte del animal y con ello determinar qué biomaterial permite obtener una regeneración del cartílago de mayor calidad estructural.   Material y métodos En colaboración con el Centro de Biomateriales e Ingeniería tisular de la Universidad Politécnica de Valencia se han elaborado microesferas de ácido poliláctico y quitosano, combinándolas con la acción potencial del PRP también en formato microesferas. Se han optimizado los protocolos de fabricación de microesferas de ácido poliláctico (PLLA) y quitosano (CHT) mediante la técnica de emulsión. Las dimensiones de partículas de PLLA fabricadas mediante el protocolo óptimo se encuentran distribuidas entre 5 y 60 µm. Y para el caso del CHT entre 60 y 110 µm. Además, se ha desarrollado un procedimiento innovador para obtener y conservar microesferas sólidas de plasma rico en plaquetas (PRP) a partir de una extracción de sangre del propio animal. Este procedimiento es en todo similar y por tanto aplicable a sangre humana, llegado el momento de la traslación a pacientes. La distribución de tamaños de estas partículas tras su criopreservación está entre 70 y 140 µm. Los soportes de microesferas de PRP, por su novedad, versatilidad, carácter autólogo y ser una fuente de factores de crecimiento, pueden ser susceptibles de patente si la evaluación histológica de los implantes realizados demuestra resultados positivos. Se ha preparado además de forma exitosa membranas de PLLA formadas por un entramado de nanofibras mediante la técnica de electrohilado, cuyo espesor ha sido de 100 µm. Se han utilizado conejos albinos New Zealand para la realización del modelo in vivo. Toda la experimentación se ha realizado siguiendo la normativa de utilización de animales de experimentación, y ha sido aprobada por el Comité ético de estudios en animales de la Universitat de València. Tras la anestesia general del animal por parte de una veterinaria, siguiendo los protocolos establecidos y visados por el Comité de Bienestar Animal de la UV, se aborda la rodilla derecha del conejo por vía parapatelar medial accediendo a la articulación, y se produce una perforación en la cara anterior del cartílago articular de la tróclea femoral de 3 mm de diámetro y 1 mm de profundidad, eliminando el cartílago articular y lesionando superficialmente por micropunción el hueso subcondral, de manera que fluya sangre al defecto labrado en el cartílago desde la médula ósea. La cavidad originada se rellena con las microesferas de los diferentes biomateriales, obteniendo los siguientes grupos: A) PLLA, B) CHT+PLLA (50/50), y C) control de cirugía (cavidad no rellenada). Los grupos experimentales se componían de 9 animales para cada tipo de microesferas y 4 para el grupo control de cirugía; para asegurar la estabilidad mecánica, en todos estos grupos se cubre la cavidad mediante una membrana con un espesor de alrededor de 100 micrómetros producida a partir de tejido de nanofibras con una composición de PLLA similar a la de las microesferas. Tras ello se cierra la herida quirúrgica por planos con monofilamento. Además, en todos los animales se utiliza la rodilla contralateral (que permaneció intacta) como control nativo (grupo D). El tiempo de experimentación para permitir la regeneración de la lesión fue de 3 meses. Transcurrido este tiempo desde la cirugía, se procedió al sacrificio de los conejos para su estudio siguiendo los protocolos establecidos y visados por el Comité de Bienestar Animal de la UV. Se extrajeron ambas rodillas, siendo la derecha la rodilla experimental, y la izquierda el control sano. Tras realizar la exéresis de las partes blandas asociadas (músculos, ligamentos y meniscos) se colocaron en frascos con osteosoft, un compuesto líquido que decalcifica las muestras, permitiendo su posterior corte para estudio histológico. Se realizaron fotografías del aspecto macroscópico de las lesiones y de las rodillas sanas. Se fotografiaron la lesión previa a su decalcificación a 0’7 y 2 aumentos, se fotografiaron nuevamente una vez realizado el corte longitudinal. Tras su inclusión en parafina y su posterior tinción con hematoxilina-eosina y tricrómico de masson para el análisis histológico y morfométrico de la calidad de los tejidos obtenidos. Como variables a analizar se midieron el grosor del neocartílago obtenido, el número y densidad celular, la cantidad de matriz, la orientación y distribución de las células y fibras, la presencia de posibles agregados en la zona subcondral correspondientes a restos del material implantado, la regularidad de la superficie articular obtenida y la categoría histológica del tejido obtenido, bien fuera cartílago hialino de aspecto articular o cartílago fibroso. Posteriormente, se procedió al análisis estadístico de los valores obtenidos, de cara a determinar si existía una diferencia significativa en los resultados y calidad del tejido en relación al biomaterial utilizado, y en comparación con la literatura se trató de dirimir el posible uso de cara a contribuir a mejorar las posibilidades terapéuticas en la regeneración de las lesiones en el cartílago articular en humanos. Resultados y Discusión Grupo A (PLLA) A modo de resumen, el grupo A habría obtenido mejores puntuaciones que los grupos B y C en a la escala ICRS macroscópica en ‘apariencia macroscópica’, existiendo significación estadística. Para el resto valores tendría resultados equiparables al grupo B y superiores al grupo C, obteniendo la mayor puntuación total y un cartílago ‘casi normal’. En la escala ICRS II microscópica obtendría mejores puntuaciones de manera estadísticamente significativa que el grupo C en las variables ‘morfología tisular’, ‘arquitectura superficial’ y ‘evaluación superficial’. Por el contrario, sus resultados en cuanto a las variables ‘metacromasia’ y ‘presencia de biomaterial’ serían peores de manera estadísticamente significativa. Obtendría resultados similares al grupo B en el resto de variables, siendo superior al grupo C, si bien no de manera significativa. Su puntuación media teniendo en cuenta todas las variables incluidas en la escala sería del 75,9%, si bien este valor sería incluyendo las variables que afectan al biomaterial. Esta puntuación se ve disminuida por las malas puntuaciones obtenidas en las tres últimas variables de la escala, ya discutidas anteriormente. Corrigiendo su puntuación mediante la exclusión de las citadas variables, su puntuación ascendería al 83,2%. La morfometría del grupo A arrojaría unos datos comparables al cartílago nativo en cuanto a ‘grosor de cartílago’, ‘grosor de hueso subcondral’ e ‘índice de interdigitación’. En cuanto a su densidad celular, sería aparentemente menor si bien no existirían diferencias significativas. Sí que destaca una mayor superficialidad de las microesferas no reabsorbidas, así como un posicionamiento más superficial de su inflamación en los casos en los que se produjo, ambas de manera estadísticamente significativa, respecto al grupo B. Grupo B (CHT + PLLA) El grupo B habría obtenido unas puntuaciones en la escala ICRS macroscópica ligeramente inferiores al grupo A. Sería superior al grupo C en la variable ‘apariencia macroscópica’ de manera estadísticamente significativa, y su puntuación total lo colocaría como un cartílago ‘casi normal’. En la escala ICRS II microscópica obtendría mejores puntuaciones de manera estadísticamente significativa que el grupo C en las variables ‘morfología tisular’, ‘metacromasia’, ‘arquitectura superficial’ y ‘evaluación superficial’. Obtendría mejores resultados con significación estadística que el grupo A en cuanto a las variables ‘metacromasia’ y ‘presencia de biomaterial’. Obtendría resultados similares al grupo A en el resto de variables, siendo superior al grupo C, si bien no de manera significativa. Su puntuación media teniendo en cuenta todas las variables incluidas en la escala sería del 84,6%. En el grupo B, a diferencia del grupo A, no existe una gran variación de su puntuación media, ya que en general obtuvo buenas puntuaciones en las variables relacionadas con el biomaterial, ya debatidas anteriormente. Corrigiendo su puntuación mediante la exclusión de las 3 variables relacionadas con el biomaterial, su puntuación descendería al 86,8%. La morfometría del grupo B arrojaría unos datos comparables al cartílago nativo en cuanto a ‘grosor de cartílago’, ‘grosor de hueso subcondral’, ‘densidad celular’ e ‘índice de interdigitación’. Sí que destaca una mayor profundidad de las microesferas no reabsorbidas, así como un posicionamiento más profundo de su inflamación en los casos en los que se produjo, ambas de manera estadísticamente significativa, respecto al grupo A. Grupo C (membrana) El grupo C habría obtenido unas puntuaciones en la escala ICRS macroscópica ligeramente inferiores a los grupo A y B. Esto sería significativo en la variable ‘apariencia macroscópica’ y su puntuación total, si bien es la más baja de las 3, lo colocaría en el límite inferior de lo que se considera como un cartílago ‘casi normal’. En la escala ICRS II microscópica obtendría peores puntuaciones de manera estadísticamente significativa que los grupos A y B en las variables ‘morfología tisular’, ‘arquitectura superficial’ y ‘evaluación superficial’. Su puntuación media teniendo en cuenta todas las variables incluidas en la escala sería del 56,3%, si bien este valor sería incluyendo las variables que afectan al biomaterial. Como en el grupo C no hubo administración de microesferas, la puntuación en la variable ‘presencia del biomaterial’ fue siempre del 100%. Corrigiendo su puntuación mediante la exclusión de las 3 variables relacionadas con el biomaterial, su puntuación descendería al 50,5%. El análisis morfométrico del grupo C muestra unos datos inferiores en cuanto a índice de interdigitación, indicando una superficie menos regular que el resto de grupos, de manera estadísticamente significativa. Posee también un menor grosor de hueso subcondral compacto bajo el cartílago de reparación, si bien esto no es estadísticamente significativo. Conclusiones Como resultado del estudio realizado y en relación a los objetivos planteados, se han alcanzado las siguientes conclusiones: 1.- Se han logrado producir reproducir lesiones condrales en las superficies articulares de la tróclea femoral de la rodilla del animal de experimentación sin incidencias. 2.- Una vez implantados los andamiajes de ácido poliláctico en forma de microesferas en las lesiones creadas y cubierto el defecto con una membrana estabilizadora de ácido poliláctico, podemos concluir que producen una regeneración cartilaginosa con un cartílago comparable al cartílago hialino articular nativo en cuanto a apariencia macroscópica, arquitectura histológica y valores morfométricos, si bien presenta en ocasiones persistencia del biomaterial. 3.- Una vez implantados los andamiajes de un combinado de microesferas, 50% de ácido poliláctico y 50% de quitosano, en las lesiones creadas y habiendo cubierto el defecto con una membrana estabilizadora de ácido poliláctico, podemos concluir que producen una regeneración cartilaginosa con un cartílago comparable al cartílago hialino articular nativo en cuanto a apariencia macroscópica, arquitectura histológica y valores morfométricos, si bien presenta en ocasiones la presencia de quistes en la zona del hueso subcondral. 4- Una vez labrado el defecto articular, en los casos en los que únicamente se cubrió con la membrana estabilizadora de ácido poliláctico sin rellenar de biomaterial, se produjo un cartílago fibroso. Si bien éste obtuvo puntuaciones aceptables en apariencia macroscópica, fue un tejido muy diferente del cartílago hialino articular en cuanto a regularidad de superficie y arquitectura histológica. 5.- Realizado el análisis estadístico de los resultados obtenidos, se concluye que tanto el ácido poliláctico por sí solo como en combinación al 50% con el quitosano producen un tejido de regeneración de calidad, que no se distingue en la mayoría de aspectos del cartílago hialino articular, y sí lo hace de manera significativa de la lesión condral sin relleno de andamiaje.