Role of peroxisome proliferator activated receptor beta/delta (pparβ/δ) agonists in the treatment of the vascular alterations in different experimental models of metabolic syndrome

Resumen

RESUMEN La disfunción endotelial desempeña un papel clave en el riesgo de desarrollo de enfermedad cardiovascular inducido por uno de los componentes esenciales del síndrome metabólico, la obesidad. El objetivo general de esta Tesis Doctoral es analizar el efecto del compuesto GW0742, agonista de receptores activados por proliferador de peroxisomas beta/delta (PPARβ/δ), sobre la función endotelial en un modelo experimental de síndrome metabólico en ratón obeso inducido por una dieta rica en grasa (HFD, high-fat diet). Para alcanzar este objetivo se han realizado varios experimentos: 1. Estudiar el efecto in vivo de la administración crónica de GW0742 Se han utilizado ratones macho de 5 semanas de edad que fueron divididos aleatoriamente en los siguientes grupos: control, control tratado con GW0742 (3 mg/kg/día, mediante sonda gastroesofágica), ratones que consumen HFD, HFD- GW0742, HFD más el antagonista de PPARβ/δ, GSK0660 (1 mg/kg/día, intraperitoneal) o HFD-GW0742-GSK0660. Los tratamientos se mantuvieron durante 11 ó 13 semanas. Los resultados mostraron que la administración de GW0742 previene la menor vasodilatación dependiente de endotelio y de óxido nítrico (NO, nitric oxide) inducida por acetilcolina (ACh, acetylcholine) en los anillos aórticos de los ratones que consumen HFD. Además, el GW0742 incrementa la fosforilación de protein cinasa B (Akt, protein kinase B) y óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS, endothelial nitric oxide synthase), e inhibe el incremento de la interacción caveolina-1/eNOS, la fluorescencia de etidio, la expresión de NOX-1, del receptor tipo Toll 4 (TLR4, Toll-like receptor 4), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α, tumor necrosis factor-α) e interleucina-6 (IL-6, interleukin-6), y la fosforilación de IκB-α en la aorta del grupo HFD. Estos cambios vasculares se acompañan con la prevención de la ganancia de peso, la hipertensión, la hipertrofia cardiaca y renal, y la acumulación de grasa inducida por el consumo de HFD. Este compuesto también suprime el incremento de los niveles plasmáticos de glucosa y triglicéridos (TG, triglycerides), la intolerancia a la glucosa y la resistencia a la insulina (determinado mediante el cálculo de HOMA-IR, homeostatic model assessment of insulin resistance) inducidos por la HFD. El GW0742 incrementa los niveles plasmáticos de lipoproteínas de alta densidad (colesterol HDL, high-density lipoprotein) y restaura los niveles de TNF-α y adiponectina en la grasa. El GSK0660 previene todos los cambios inducidos por GW0742. Se concluye que la activación PPARβ/δ reduce la obesidad y ejerce efectos protectores sobre la hipertensión y sobre manifestaciones tempranas de la aterosclerosis, incluyendo la disfunción endotelial y el estado pro-oxidante y pro-inflamatorio vascular en ratones que consumen HFD. 2. Estudiar los efectos del GW0742, independientes de sus efectos metabólicos sistémicos, sobre la disfunción endotelial inducida por lípidos Un aumento de especies reactivas de oxígeno (ROS, reactive oxygen species) y una reducida biodisponibilidad de NO están involucrados en la disfunción endotelial inducida por los ácidos grasos. En esta Tesis se demuestra que en células endoteliales de aorta de ratón (MAEC, mouse aortic endothelial cells) el GW0742 previene la disminución de la producción de NO estimulada por el ionóforo de calcio A23187 y de la fosforilación de la eNOS en la Ser1177, y el incremento de los niveles intracelulares de ROS causados por la exposición a palmitato in vitro. Este agonista PPARβ/δ también restaura la relajación dependiente de endotelio inducida por ACh en aorta de ratón incubada con palmitato. In vivo, el tratamiento durante 3 semanas con GW0742 (3 mg/kg/día) previene la reducción de la relajación de ACh y de la fosforilación de eNOS en la Ser1177, y el incremento de la producción de ROS y de la actividad del sistema nicotinamín adenín dinucleótido fosfato (NADPH, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) oxidasa en la aorta de ratones que consumen una HFD. El antagonista de PPARβ/δ GSK0660 suprimió todos los efectos protectores inducidos por el GW0742. El GW0742 aumenta la expresión vascular de carnitina palmitoil transferasa-1 (CPT-1, carnitine palmitoyltransferase-1). Los efectos del GW0742 sobre la relajación inducida por ACh en aorta y sobre la producción de NO y ROS en MAEC expuestas a palmitato se suprimen por el inhibidor de CPT-1 etomoxir y por silenciamiento de CPT-1. El GW0742 también inhibe el aumento de diacilgicerol (DAG, diacylglycerol), la activación de la protein cinasa Cα/βII (PKCα/βII, protein kinase Cα/βII) y la fosforilación de eNOS en la Thr495 inducido por palmitato en MAEC, efectos que se suprimen con etomoxir. Todos estos hallazgos indican que la activación PPARβ/δ abole la disfunción endotelial inducida por lípidos por una sobreexpresión de CPT-1 en las MAEC, lo que reduce la acumulación de DAG y la subsiguiente producción de ROS e inhibición de la eNOS mediada por PKC. La resistencia a insulina inducida por ácidos grasos en células endoteliales se caracteriza por un aumento de ROS y una reducida biodisponibilidad de NO. En esta Tesis se demuestra que, en células endoteliales de vena de cordón umbilical humano (HUVEC, human umbilical vein endothelial cells), el GW0742 previene la disminución de la producción de NO y de la fosforilación de la eNOS en la Ser1177 estimulada por insulina, y el incremento de los niveles intracelulares de ROS causados por la exposición a palmitato in vitro. Los efectos protectores del GW0742 se suprimen tanto por el antagonista PPARβ/δ GSK0660 como por el inhibidor de CPT-1 etomoxir. De todo ello se concluye que la activación PPARβ/δ in vitro previene el deterioro de la señalización de la insulina inducida por palmitato, lo que conduce a un aumento de la producción de NO estimulada por insulina en HUVEC. Este efecto protector podría ser debido al aumento de la expresión de CPT-1, que normaliza la producción de ROS y restaura la vía de señalización de la insulina IRS (insulin receptor substrate)-Akt-eNOS. 3. Estudiar los efectos del GW0742 sobre la disfunción endotelial inducida por lipopolisacarido (LPS, lipopolysaccharide) La endotoxina bacteriana LPS activa vías inflamatorias, induce la expresión de citocinas en el endotelio, aumenta la producción de ROS en la pared vascular e induce disfunción endotelial. Los niveles plasmáticos de LPS están aumentados en individuos obesos y en ratones con obesidad inducida por HFD (endotoxemia metabólica). El tratamiento crónico con GW0742 no modifica los niveles plasmáticos de LPS. En esta Tesis también hemos analizado si la activación PPARβ/δ modifica la inflamación, el estrés oxidativo y la disfunción endotelial inducidos por LPS en ratón. Se ha encontrado que el tratamiento in vivo con GW0742 previene la reducción de la relajación dependiente de endotelio, el incremento de la producción vascular de ROS, la regulación al alza de los niveles vasculares de mRNA de NOX-1, NOX-2, p47phox y p22phox, y de los marcadores de estrés de retículo endoplasmático (ER, endoplasmic reticulum) inducidos por LPS en ratón. En MAEC, el GW0742 previene la disminución de la producción de NO estimulada por A23187 y el incremento de los niveles intracelulares de ROS causados por la exposición a LPS in vitro. El antagonista de PPARβ/δ GSK0660 suprime todos los efectos protectores in vivo e in vitro provocados por el GW0742. Este agonista también normalizó la reducida expresión de la proteína desacoplante-2 (UCP2, uncoupling protein-2) y de la proteína de fusión mitocondrial, mitofusin-2, inducida por LPS. Los efectos del GW0742 sobre la producción de NO y de ROS en MAEC expuestas a LPS se suprimen por el inhibidor de UCP2 genipín y por el silenciamiento de UCP2. El genipín también suprime los cambios en la expresión de las subunidades de la NADPH oxidasa y de los marcadores de estrés del ER inducidos por GW0742. En conjunto se observa que la activación PPARβ/δ reduce la disfunción endotelial inducida por LPS mediante la regulación al alza de UCP2 endotelial, con la subsiguiente inhibición del estrés del ER y de la actividad NADPH oxidasa, lo que conduce a la reducción de la producción de ROS y al aumento de la biodisponibilidad de NO. Todos estos experimentos indican que la activación de PPARβ/δ previene la aparición de uno de los acontecimientos iniciales en el desarrollo de la placa de ateroma, la disfunción endotelial. La aterogénesis es la base patológica sobre la que se sustenta la enfermedad cardiovascular (angina, infarto), que es primera causa de muerte de los pacientes con síndrome metabólico. La mejora de factores que deterioran la función endotelial, tales como parámetros metabólicos sistémicos (hiperglucemia, intolerancia a la glucosa, HOMA-IR, trigliceridemia, niveles de HDL), citocinas pro-inflamatorias y presión arterial elevada contribuye a este efecto protector en situación de obesidad. Además, la activación PPARβ/δ en el lecho vascular (acciones vasculares directas) también está involucrada en la mejora de la disfunción endotelial asociada al síndrome metabólico. Así, el incremento de la oxidación de ácidos grasos en el endotelio, mediada por el gen diana de PPARβ/δ CPT-1, mejora no solo la respuesta relajante inducida por activación calcio-dependiente de eNOS, sino también la producción de NO provocada por fosforilación de la eNOS mediante insulina. La activación de otro gen PPARβ/δ como el UCP2 protege al endotelio del efecto deletéreo de la endotoxemia metabólica. Estos hallazgos sugieren que los agonistas PPARβ/δ, como el GW0742, poseen un potencial terapéutico en la prevención de la disfunción endotelial, y en consecuencia de la enfermedad cardiovascular, en situaciones de obesidad. REFERENCIAS Toral M, Romero M, Perez-Vizcaino F, Duarte J, Jimenez R. Antihypertensive effects of Peroxisome proliferator-activated receptor β/δ activation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2016 (in press). Toral M, Romero M, Jiménez R, Robles-Vera I, Tamargo J, Martínez MC, Pérez-Vizcaíno F, Duarte J. Role of UCP2 in the protective effects of PPARβ/δ activation on lipopolysaccharide-induced endothelial dysfunction. Biochem Pharmacol. 2016; 110-111:25-36. Toral M, Romero M, Jiménez R, Mahmoud AM, Barroso E, Gómez-Guzmán M, Sánchez M, Cogolludo Á, García-Redondo AB, Briones AM, Vázquez-Carrera M, Pérez-Vizcaíno F, Duarte J. Carnitine palmitoyltransferase-1 up-regulation by PPAR-β/δ prevents lipid-induced endothelial dysfunction. Clin Sci (Lond). 2015; 129:823-37. Toral M, Gómez-Guzmán M, Jiménez R, Romero M, Zarzuelo MJ, Utrilla MP, Hermenegildo C, Cogolludo Á, Pérez-Vizcaíno F, Gálvez J, Duarte J. Chronic peroxisome proliferator-activated receptorβ/δ agonist GW0742 prevents hypertension, vascular inflammatory and oxidative status, and endothelial dysfunction in diet-induced obesity. J Hypertens. 2015; 33:1831-44.