Análisis global de la familia multigénica masp (mucin associated surface proteins) de trypanosoma cruzi

Resumen

En esta tesis se ha analizado el perfil de expresión de la familia MASP (Mucin Associated Surface Proteins) de Trypanosoma cruzi, caracterizándose algunos de sus miembros, así como evaluándose la respuesta inmune humoral generada frente al extremo C-terminal de esta familia de proteínas. Trypanosoma cruzi es el protozoo parásito kinetoplástido, con el ciclo de vida más complejo de su familia, poseyendo distintas estadíos durante su ciclo (epimastigote, tripomastigote metacíclico, tripomastigote sanguíneo y amastigote) ya sea en el insecto vector como en su hospedador definitivo y necesitando replicarse de una manera intracelular. Tras la secuenciación del genoma de T.cruzi, se sabe que la expansión de este es la mayor dentro de los kinétoplástidos secuenciados hasta ahora, tanto en su tamaño total como en su número de genes. El genoma se compone de un gran número de familias multigénicas, posiblemente debido al gran número de tipos celulares que invade este parásito, así como para generar un mecanismo de evasión de la respuesta inmune semejante al que sucede con las proteínas VSG de T.brucei. La familia multigénica MASP (Mucin Associated Surface Proteins), única de T.cruzi, ha sido recientemente descrita a raíz de la secuenciación del genoma, constituyéndose por 1377 genes de los cuales 433 eran pseudogenes. Esta familia posee una hipervariabilidad en la región central de sus secuencias muy elevada, siendo una elevada fuente de recursos para el desarrollo de T.cruzi durante su ciclo de vida. Debido a que el descubrimiento de la familia MASP es relativamente reciente, no existen muchos datos sobre esta, sobre todo acerca de su posible funcionalidad para el parásito. Tras evaluar si existía algún miembro secretado por la fase tripomastigote metacíclico al medio de interacción célula-parásito mediante aproximaciones proteómicas, se identificaron dos proteínas que se denominaron como MASP52 y MASP5. Tras caracterizar la primera encontramos que esta poseía un patrón de expresión diferencial entre los diferentes estadíos del parásito, descubriéndose la posible implicación de ésta en el proceso de infección en la célula, mediante el uso de anticuerpos frente a ésta. Por otra parte, se evaluó la alta conservación de los extremos 5'y 3'de las secuencias de éstos genes entre cepas de diferente origen geográfico y linaje, no encontrándose la presencia de esta familia en otros kinetoplástidos (Leishmania major, Trypanosoma rangeli, and Blastocrithidia sp.) utilizando los extremos conservados MASP como marcadores moleculares. También se descubrió el alto poder mutacional de esta familia, tras evaluar la región hipervariable del gen MASP52, el cual generaba patrones polimórficos en 22 cepas de todos las Unidades Discretas de Tipificación (DTUs) descritas en la actualidad. Tras estudiar el perfil de expresión de miembros de esta familia en la fase tripomastigote metacíclico en las cepas PAN4, CL-Brener y Maracay, se amplificaron, clonaron y secuenciaron un total de 15 transcritos 8 de los cuales correspondían a genes MASP y 7 a pseudogenes MASP transcritos. Por tanto, este parásito es capaz de expresar parte de su pseudogenoma de manera activa en todas las cepas objeto de estudio. Dentro de las secuencias analizadas se obtuvieron sitios específicos de insercción para el retroelemento TcTREZO, postulándose a éstos, como sitios específicos de recombinación homóloga, que pudieran generar nuevos genes y pseudogenes MASP. Tras utilizar como modelo el pseudogen MASP2¿1CL, determinamos que éste era capaz de generar dúplex RNA-RNA estables, que pueden servirle al parásito como mecanismo de regulación postranscripcional alternativo al de RNA interferente. Para evaluar la respuesta humoral frente a la secuencia consenso del extremo C-terminal de las proteínas MASP, se realizó un mapeo de epítopos B utilizando péptidos solapantes para dicha secuencia. Todos los péptidos obtuvieron una respuesta positiva frente a un pool de sueros positivos de pacientes enfermos chagásicos, siendo los péptidos con mejores resultados los denominados como c1, c2 y c7. Al enfrentar estos péptidos a distintos grupos de sueros de diferente momento y procedencia para la enfermedad de Chagas, fue el péptido c1 el que mejor sensibilidad ofreció con un 93.8% y con una rápida respuesta IgM en ratones infectados (títulos positivos a los 13 días postinfección), postulándose como marcador diagnóstico temprano de la enfermedad de Chagas. Por tanto, la familia multigénica MASP es vital para la biología y supervivencia de T. cruzi en su hospedador, tanto como mecanismo de evasión de la respuesta inmune, como ligandos para invadir las células hospedadoras como proteínas en respuesta a situaciones de estrés. Tras su amplificación clonamos un total de 14 genes masp, cuyos extremos son altamente conservados, poseyendo una zona central Hipervariable entre genes de la misma o diferente especie. La amplificación de los extremos N y C- terminal dio como resultado que los dos extremos se mantienen en las tres cepas de T.cruzi, si bien la hipervariabilidad de estos genes es diferentes siendo la cepa PAN 4 la que mantiene una constancia mayor para sus extremos. Al sondear si esta familia se encuentra en otros trypanosomátidos hallamos que solo amplificaba(además de T.cruzi) el extremo C-terminale de las masp en T.rangeli. A lo largo del ciclo intracelular obtuvimos una expresión diferencial de la familia y los genes masp. Por Fluorescencia obtuvimos que todas las fases en todo momento expresan este tipo de proteínas. Conclusiones. La familia masp es específica de T.cruzi manteniéndose constante su expresión entre diferentes cepas de este parásito, por tanto es una diana terapéutica excelente para su estudio en futuras investigaciones