Análisis de los perfiles de expresión génica en cáncer de pulmón. Valor pronóstico en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico sometidos a toracotomía

Resumen

El cáncer de pulmón es después de la enfermedad cardiovascular, la primera causa de muerte en la población occidental a pesar de los numerosos avances en la detección temprana y la estandarización del tratamiento. En esta población los tipos de cáncer que más muerte causan son el cáncer de pulmón, el colorrectal, el de mama y el de próstata. De todos ellos el de pulmón causa más muertes que todos los otros juntos. Cada año se diagnostican más de 1,6 millones de casos en todo el mundo, de los cuales, menos del 15% logran sobrevivir cinco años tras el diagnóstico. Esta elevada tasa de mortalidad reside en el avanzado estado en el que el tumor se encuentra en los pacientes diagnosticados, pudiendo llegar a ser de estadio III o metastásico (IV), lo que se correlaciona con una peor prognosis. De todos estos cánceres de pulmón, el 80% se clasifican como cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), mientras que el 20% restante lo hacen como cáncer de pulmón microcítico (SCLC). Los adenocarcinomas (AC) y carcinomas escamosos o epidermoides (SCC) son los subtipos histológicos más frecuentes del NSCLC, y presentan diferente pronóstico y tratamiento. Con el objetivo de incrementar nuestro conocimiento de la biología del cáncer y para determinar cualquier correlación entre la heterogeneidad fenotípica y la diversidad genética del cáncer de pulmón, nuestro grupo de investigación llevó a cabo en estudios previos el análisis de los perfiles de expresión génica de un conjunto de 46 muestras de tumores primarios de adenocarcinoma (AC) y carcinoma escamoso o epidermoide (SCC), y 45 muestras pareadas no tumorales (control) con el propósito de determinar secuencias génicas diferencialmente expresadas en base a los distintos estadios de la enfermedad e identificar secuencias con significado biológico en la progresión tumoral. En dichos estudios se encontraron diferencias significativas entre los perfiles de expresión de muestras de AC y SCC. El análisis estadístico utilizado para seleccionar las secuencias diferencialmente expresadas también permitió la identificación de perfiles de expresión génica distintos para diferentes estadios de la enfermedad y entre los distintos grados de diferenciación. La presente Tesis Doctoral pretende estudiar en profundidad estos genes desregulados como consecuencia del proceso tumoral de NSCLC, lo cual permite la identificación y validación de genes con valor pronóstico, así como, nuevas dianas terapéuticas en adenocarcinomas y carcinomas epidermoides pertenecientes al estadio I con distinto grado de diferenciación tumoral. Los resultados, una vez validados por qPCR, permitieron diferenciar los fenotipos tumorales (muestra tumoral de muestra control no tumoral), AC de SCC (incluyendo los estadios I y IB) y grados de diferenciación. Así, estos análisis ofrecen una mejor clasificación molecular del cáncer del pulmón. De entre los genes diferencialmente expresados, se hallaron resultados interesantes para tres componentes del desmosoma: Pkp1, Dsg3 y Krt15. Los genes Pkp1 y Krt15 estaban altamente sobreexpresados en los SCC, lo que sugiere que podrían ser marcadores útiles para diferenciar las muestras del subtipo epidermoide. Por otro lado, el gen Dsg3 mostró una fuerte inhibición en AC de estadio IA frente a AC de estadio IB, lo que indica que podría servir como marcador para distinguir el estadio IA de AC. Las especializaciones de membrana de células epiteliales, tales como las uniones estrechas (o zonula occludens), uniones adherentes (o zonula adherens) o desmosomas entre otras, son esenciales para la homeostasis en los organismos pluricelulares. Las proteínas transmembrana implicadas en estas uniones, se encuentran unidas a componentes del citoesqueleto, estableciendo así conexiones con otros sitios de adhesión célula-célula o célula-matriz extracelular. Además, cada vez más moléculas estructurales citoplasmáticas relacionadas con este tipo de uniones, se encuentran involucradas en la regulación de diversos procesos como la transcripción, proliferación celular, polaridad celular y la formación de barreras de difusión regulada. En el caso concreto de los desmosomas, además de tener una función estructural, un número creciente de estudios muestran que son estructuras dinámicas que participan en procesos celulares más allá de la adhesión, como la morfogénesis y la diferenciación de los tejidos, y actúan como centros de señalización celular compuestos por un amplio abanico de moléculas de membrana específicas de tejido y moléculas de enlace entre membrana y citoesqueleto. El presente trabajo de investigación ha tratado también de establecer la correlación de los perfiles de expresión hallados con los distintos tipos histológicos tumorales y con la supervivencia, recidiva tumoral e intervalo libre de enfermedad en los pacientes seleccionados. Definir este tipo de correlaciones ayudará a establecer el valor pronóstico de los genes desregulados en pacientes de NSCLC sometidos a toracotomía con objetivos de resección completa, incompleta o diagnóstica. Los resultados del análisis de supervivencia mediante el método Kaplan-Meier presentaron un resultado significativo para el uso de terapias adyuvantes en pacientes con afección ganglionar, aunque la administración de terapia adyuvante no influyó en la supervivencia del paciente tras el control de las otras variables y podría estar asociado al estadio TNM según la 7ª edición. Además, el análisis de la supervivencia de los pacientes fue diferente dependiendo de la edición de los criterios de clasificación TNM usada, aunque se encontraron diferencias significativas en función de la recurrencia tumoral y en función del estadio TNM con ambas ediciones TNM (6ª y 7ª edición). Por otro lado, el subtipo histológico del cáncer no influyó en la supervivencia del paciente. Tampoco se encontró ninguna relación estadísticamente significativa entre la media de supervivencia y los niveles de expresión de Pkp1 o Krt15, o entre la media de supervivencia y la expresión simultánea de ambos genes. El análisis inmunohistológico de las muestras mostró que la expresión de PKP1 y KRT15 generalmente se restringió a carcinomas epidermoides (SCC) y se localizó principalmente en las membranas, aunque también en citoplasma y, en menor medida, en núcleo. La expresión de estas proteínas fue más extensa e intensa en tumores bien-moderadamente diferenciados, especialmente en las membranas. Por otro lado, en nuestro conjunto de muestras no se observó tinción de PKP1 ni KRT15 en el citoplasma o membrana de adenocarcinomas (AC), y sólo una pequeña parte de las muestras presentaron tinción nuclear de estas proteínas. Por otro lado, el patrón de tinción de DSG3 también difirió según el subtipo histológico (AC o SCC), presentando ausencia de tinción en membranas en los casos de AC. Así, teniendo en cuenta los patrones de tinción de las 3 proteínas, la tinción de membrana fue característica de los SCC de pulmón y se pudo observar una relación entre la expresión de estas proteínas en la membrana de SCC y el grado de diferenciación, indicando que podrían ser marcadores de SCC útiles en el diagnóstico diferencial del cáncer de pulmón. Esta Tesis también ha tratado de validar mediante una serie de ensayos funcionales el papel en el proceso tumorogénico del gen Pkp1. Así, el silenciamiento génico de Pkp1, el cual se demostró por diversos métodos, disminuyó significativamente la proliferación celular entre un 15 y un 20%, redujo el número y tamaño de las colonias formadas, produjo parada del ciclo celular (entre un 11 y un 16%) con alteraciones en los niveles de expresión de p16 y p21 e incrementó la apoptosis por la vía de la activación de la caspasa 3 dando lugar a un aumento de la mortalidad 4,5 veces superior. En algunas líneas incluso produjo cambios en la morfología celular. Por el contrario, la sobreexpresión de Pkp1 mediante transducción vírica de células sin expresión basal del mismo, incrementó significativamente la proliferación de las mismas en un 30%. La inmunocitoquímica mostró patrones de tinción citoplasmática y desmosomales, y una fuerte y heterogénea localización subcelular de PKP1 en núcleo (a excepción de los nucleolos) que mostró ser específica. Además, reveló distintos patrones de fuerte señal que podrían corresponderse con los cuerpos medios (midbodies) y con los cinetocoros. Durante la mitosis se produjo un incremento de la señal citoplasmática y periférica de PKP1 debido a la diseminación de la proteína nuclear. Hasta la fecha, los resultados aquí presentados son, para nuestro conocimiento, los primeros datos que relacionan PKP1 con distintas fases de la mitosis a través de su localización en midbodies y cinetocoros. En resumen, nuestro estudio en conjunto con lo publicado en la bibliografía previa, aporta evidencias del papel oncogénico de Pkp1 en NSCLC demostrando que existen patrones de expresión específicos que resaltan las diferencias histológicas y comportamientos clínicos de estos tumores. Además, los datos aquí presentados reafirman que Pkp1 juega un papel directo en el control del crecimiento celular, aportando características agresivas a los NSCLC, y abren la posibilidad de diseñar nuevos biomarcadores de cáncer de pulmón y drogas anti-cáncer específicas basados en la molécula de PKP1. Sin embargo, existe una hipótesis que plantea un papel dual dependiente de contexto para PKP1 en carcinogénesis. Esta hipótesis de la dualidad de PKP1 en cáncer, propuesta por Wolf et al. en 2013, plantea que el papel oncogénico o supresor tumoral que desempeña PKP1 está relacionado con la localización subcelular del mismo, y que dicha localización podría depender de su estado de fosforilación. Así, PKP1 jugaría una función estructural y un papel de protección frente al cáncer en los desmosomas, mientras que en el citoplasma (y posiblemente en el núcleo) estimularía la proliferación como un oncogén a través de la liberación de componentes con potencial oncogénico y de la activación de rutas de señalización implicadas en el desarrollo tumoral. El equilibrio entre las rutas implicadas en tumorogénesis y supresión tumoral, determinaría el papel de PKP1 en cada caso. Las rutas a través de las cuales Pkp1 podría estar implicada en tumorogenicidad son la vía de señalización de PI3K/AKT2 y la regulación de la traducción dependiente del factor de inicio de la traducción eIF4A1. La importancia de este estudio reside en que los datos aquí presentados implican un mayor entendimiento acerca de las alteraciones génicas encontradas en NSCLC. Sin embargo, resulta esencial definir completamente las interacciones proteicas y rutas de señalización en las que está implicada PKP1 para arrojar luz sobre la base molecular del cáncer de pulmón y sobre la función tumorogénica de las PKPs, las cuales están atrayendo cada vez más atención de la comunidad científica.