Ethylene perception by ETR3 determines plant interaction with plant growth promoting bacteria in tomato (Solanum lycopersicum)

Resumen

La percepción de etileno a través de ETR3 determina la interacción de las plantas con bacterias promotoras del crecimiento vegetal en tomate (Solanum lycopersicum) Pablo Ibort Pereda Introducción La intensificación sostenible de la agricultura persigue proporcionar seguridad alimentaria a una población mundial creciente y al mismo tiempo reducir los efectos negativos medioambientales de la agricultura (Tilman et al. 2011). Por ello, se deben desarrollar nuevas estrategias con el objetivo de incrementar la eficiencia de los cultivos en la utilización de recursos manteniendo los rendimientos actuales (Dodd and Ruiz-Lozano 2012). El manejo de microorganismos rizosféricos es una buena estrategia para inducir el crecimiento vegetal (Berg 2009; Singh et al. 2011), y podría disminuir la utilización de productos químicos en agricultura (Bhattacharyya and Jha 2012). Sin embargo, es necesaria una mayor investigación para comprender completamente la interacción entre plantas y microorganismos, así como los mecanismos de acción bacterianos, y utilizar dichos microorganismos de manera adecuada y efectiva a gran escala en los sistemas de agricultura integrada (Berg 2009). Los microorganismos rizosféricos se encuentran asociados con los ciclos biogeoquímicos de los nutrientes (Barea et al. 2005), y la interacción planta-bacteria es esencial para una mejor nutrición vegetal (Ryan et al. 2009). Además, la homeostasis nutricional y hormonal de la plantas se encuentran estrechamente relacionadas regulando finamente el crecimiento y desarrollo de la planta (Krouk et al. 2011). Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB) pueden actuar bien directamente o indirectamente (Ortíz-Castro et al. 2009) y existen varios mecanismos implicados en la modulación de los niveles de etileno. El etileno es una hormona vegetal inducida típicamente en respuesta a estreses ambientales como la sequía (Pierik et al. 2007). Algunas cepas de PGPB han sido definidas como reguladores del estrés (Lugtenberg and Kamilova 2009), ya que contienen la actividad 1-aminociclopropano-1-carboxílico deaminasa (ACCd) y son capaces de reducir los niveles de etileno, y en consecuencia disminuir sus efectos inhibidores del crecimiento (Abeles et al. 1992; Glick 2014). Recientemente las técnicas -ómicas han contribuido a esclarecer la interacción entre plantas y bacterias, pero se requerire más investigación ya que los mecanismos de acción de las PGPB son a menudo específicos de cada cepa bacteriana (Long et al. 2008) y se encuentran poco caracterizados (Pühler et al. 2004). Además, las raíces son el nicho bacteriano dónde tiene lugar la interacción directa entre plantas y bacterias (Benizri et al. 2001). Las aproximaciones transcriptómicas y proteómicas, así como la información metabólica, han contribuido con información valiosa para desentrañar la interacción planta-bacteria así como para predecir cambios fisiológicos (van de Mortel et al. 2012; Feussner and Polle 2015; Su et al. 2016). La presente Tesis Doctoral persigue principalmente arrojar luz sobre la interacción entre dos bacterias promotoras del crecimiento vegetal y plantas de tomate en relación con la sensibilidad a etileno mediante el uso de diferentes metodologías con el objetivo de elucidar los mecanismos de acción bacteriana. En consecuencia, el mutante insensible a etileno never ripe (nr) (incapaz de percibir etileno debido a una mutación en el receptor de etileno SlETR3) (Lanahan et al. 1994; Wilkinson et al. 1995), y su parental isogénico de tipo silvestre (wild-type; wt) de tomate (Solanum lycopersicum) cultivar Pearson fueron seleccionados para ser inoculados con cepas PGPB aisladas de suelos áridos de la zona sur de España: Bacillus megaterium (Bm) (Marulanda-Aguirre et al. 2008) y Enterobacter sp. (en adelante Enterobacter C7 (C7)). Debido a que la mayoría de los estudios sobre el papel del etileno en la actividad PGPB se han centrado en bacterias que son capaces de reducir los niveles de ACC (Glick 2014), este estudio pretende utilizar bacterias sin actividad ACC deaminasa o la capacidad de producir etileno para evitar cualquier perturbación directa del metabolismo del etileno de la planta. Capítulo 1: La sensibilidad a etileno a través de ETR3 es esencial en la interacción de tomate con Bacillus megaterium pero no con Enterobacter C7. El primer capítulo tiene como objetivo establecer si la percepción de etileno a través de SlETR3 es crítica para la inducción del crecimiento promovida por dos cepas PGPB diferentes y evaluar los efectos bacterianos en la emisión de etileno y la expresión génica en plantas de tomate adultas. Se cultivaon plantas never ripe y de tipo silvestre inoculadas con B. megaterium o Enterobacter C7 hasta el estadío adulto (10 semanas de edad; 8 semanas post-inoculación; inicio de la floración) bajo condiciones de buen riego y sequía con el objetivo de analizar la promoción del crecimiento así como los efectos de la inoculación bacteriana sobre la producción de etileno, la expresión de genes relacionados con el etileno y los perfiles transcriptómicos de la raíz. La inoculación de Enterobacter C7 promovió el crecimiento de las plantas independientemente de la sensibilidad a etileno, mientras que la actividad PGPB de B. megaterium fue observada únicamente en plantas de tipo silvestre. Además, ambas cepas PGPB disminuyeron la expresión de genes de biosíntesis de etileno dando lugar a la mitigación de los efectos de la sequía en plantas de tipo silvestre. Sin embargo, la insensibilidad a etileno comprometió la interacción con B. megaterium, el cual indujo la transcripción de genes de biosíntesis y respuesta a etileno causando un ligero estrés biótico (Timmusk and Wagner 1999). La inoculación de PGPB afectó los perfiles transcriptómicos dependiendo de la cepa bacteriana, el genotipo de la planta y la sequía alterando genes implicados en respuesta frente a estrés oxidativo y la acumulación de metabolitos además del estado hormonal y nutricional de la planta. Por ello, la sensibilidad a etileno se ha propuesto como determinante para la adecuada interacción entre PGPB y las plantas de tomate. Enterobacter C7 podría modular el metabolismo amino acídico independientemente de la percepción de etileno. No obstante, la mutación never ripe causa una interacción no completamente funcional con B. megaterium, produciéndose un mayor estrés oxidativo y la pérdida de la actividad PGPB. De ese modo, la percepción de etileno mediante el receptor SlETR3 es crucial para la actividad promotora del crecimiento de B. megaterium, y afecta sólo levemente a los efectos de Enterobacter C7. Capítulo 2: La inoculación de cepas PGPB modifica características fotosintéticas y el perfil metabólico de la raíz además de los estados nutricionales y hormonales de la planta con una fuerte influencia de la sensibilidad a etileno. El segundo capítulo tiene como objetivo establecer si la percepción de etileno es determinante para la interacción planta-bacteria y la inducción del crecimiento mediado por ambas cepas PGPB en plantas juveniles, así como evaluar los efectos fisiológicos de dichas cepas en plantas de tomate juveniles y adultas. Se cultivaron plantas never ripe y de tipo silvestre inoculadas con B. megaterium o Enterobacter C7 hasta los estadíos juvenil (6 semanas de edad; 4 semanas post-inoculación) y adulto cuando se evaluó la biomasa, conductancia estomática y características fotosintéticas además de los estados nutricionales, hormonales y metabólicos. No se observó promoción del crecimiento en plantas juveniles. Sin embargo, la inoculación de Bm y C7 disminuyó y aumentó la tasa de crecimiento relativo en plantas never ripe, respectivamente. Además, la inoculación de PGPB afectó los parámetros fisiológicos medidos y el contenido en metabolitos de la raíz en plantas juveniles, mientras que la nutrición vegetal fue fuertemente alterada dependiendo de la sensibilidad a etileno en plantas en estadío adulto. La inoculación de B. megaterium mejoró la asimilación de carbono en plantas de tipo silvestre. Sin embargo, la insensibilidad a etileno comprometió la actividad PGPB de B. megaterium afectando a la eficiencia fotosintética, la nutrición vegetal y el contenido en azúcares de la raíz. No obstante, la inoculación de Enterobacter C7 modificó el contenido en amino ácidos de la raíz además de la conductancia estomática y la nutrición vegetal. Por ello, la sensibilidad a etileno determina la interacción de las plantas con las PGPB y perjudica gravemente a la interacción de B. megaterium con las plantas de tomate dando lugar a modificaciones fisiológicas y la pérdida de la actividad promotora del crecimiento. En cambio, la inoculación de Enterobacter C7 estimuló el crecimiento de la planta independientemente de la percepción de etileno y podría mejorar la asimilación de nitrógeno en plantas insensibles a etileno. Capítulo 3: La percepción de etileno determina el resultado de la interacción planta-bacteria dando lugar a una reestructuración de la nutrición de fósforo y el estado antioxidante de la planta. El presente capítulo tiene como objetivo arrojar luz sobre la interacción planta-bacteria y los mecanismos de acción PGPB en relación con la percepción del etileno utilizando una aproximación proteómica. Se cultivaron plantas never ripe y de tipo silvestre inoculadas con B. megaterium o Enterobacter C7 hasta el estadío adulto para analizar la promoción del crecimiento así como los efectos de la inoculación bacteriana sobre los perfiles proteómicos microsomales de la raíz, los cuales pueden aportar información útil sobre procesos de interacción, señalización y transporte. Los resultados de la promoción del crecimiento vegetal fueron acordes con los obtenidos en anteriores capítulos. Además, la inoculación de PGPB afectó al perfil proteómico de una manera dependiente de la cepa bacteriana y la sensibilidad a etileno de la planta modificando niveles de proteínas de interacción y relacionadas con el estrés. Además, la inoculación bacteriana afectó el estado antioxidante y la capacidad de adquisición de fósforo de la planta. De hecho, se evaluaron el estado redox y la nutrición de fósforo y se realizó un ensayo con condiciones de bajo fósforo en base a los resultados proteómicos obtenidos. La inoculación de B. megaterium incrementó y disminuyó la capacidad antioxidante en plantas de tipo silvestre y never ripe, respectivamente, mientras que la inoculación de C7 aumentó el estrés oxidativo en ambos genotipos de plantas. Por ello, la percepción a etileno es esencial para el adecuado reconocimiento de B. megaterium y su promoción del crecimiento, la cual es mediada en parte por niveles elevados de glutatión reducido mejorando la capacidad antioxidante de la planta. En cambio, Enterobacter C7 es capaz de mejorar la nutrición de fósforo de la planta independientemente de la sensibilidad a etileno, modulando la respuesta de estrés inducida por el bajo fósforo disponible y manteniendo de esta forma las plantas en crecimiento. Discusión General La inoculación con PGPB modificó los pérfiles nutricionales, transcriptómicos, metabólicos y proteómicos de una manera específica de cada cepa PGPB inoculada y dependiente de la sensibilidad a etileno de la planta en concordancia con interacciones específicas entre plantas hospedadoras y cepas PGPB (Walker et al. 2011; Weston et al. 2012), así como de mecanismos de acción también específicos de cepa y dependientes de las condiciones de crecimiento de las plantas (Ryu et al. 2005; Long et al. 2008). La inoculación de PGPB modificó directamente los metabolitos de la raíz incluyendo amino ácidos, azúcares y ácidos orgánicos como se había descrito anteriormente (Weston et al. 2012; Su et al. 2016), los cuales podrían intervenir en la promoción del crecimiento vegetal así como en la interacción planta-bacteria. Además, la insensibilidad a etileno causó mayores diferencias que la inoculación bacteriana ya que el etileno está involucrado en varios procesos importantes en la fisiología de la planta así como en la plasticidad fenotípica (Dugardeyn and Van Der Straeten 2008). El presente estudio describe por primera vez un mecanismo dependiente de etileno en bacterias sin actividad ACC deaminasa. Ambas PGPB (Bm y C7) fueron capaces de colonizar el sistema radicular independientemente de la sensibilidad a etileno, lo cual es determinante para la interacción con las plantas (Benizri et al. 2001). Sin embargo, aunque la sensibilidad a etileno determina la interacción de las plantas con ambas cepas PGPB, se propone la percepción del etileno a través de SlETR3 como esencial para la promoción del crecimiento mediada por Bm pero no por C7. Además, la inoculación con PGPB mejoró su eficiencia de promoción del crecimiento en plantas de tipo silvestre bajo condiciones de sequía, sugiriendo la mitigación del estrés como previamente ha sido descrito con otras cepas PGPB (Aroca and Ruiz-Lozano 2009), y la mejora de la eficiencia en la utilización de recursos (Dodd and Ruiz-Lozano 2012). El análisis hormonal vegetal mostró que la inoculación de C7 modula el contenido de ácido abscísico (ABA) en plantas never ripe juveniles suprimiendo la respuesta mediada por ácido salicílico (SA) y/o ácido jasmónico (JA)/etileno (Anderson et al. 2004; Sánchez-Vallet et al. 2012). En cambio, los niveles de ABA endógeno podrían ser esenciales para la promoción del crecimiento mediada por Bm manteniendo la producción de etileno en niveles bajos (Porcel et al. 2014). Los mayores niveles de SA, JA y jasmónico-isoleucina bajo la inoculación de Bm en plantas never ripe respecto a plantas de tipo silvestre sugiere que Bm activa defensas en plantas never ripe (Browse 2009; Vlot et al. 2009). Por ello, los efectos bacterianos sobre los niveles hormonales descritos en plantas juveniles predisponen a las plantas al crecimiento futuro ya que existe un balance entre crecimiento y defensa, el cual implica una interferencia entre las diferentes hormonas vegetales (Karasov et al. 2017). La inoculación de B. megaterium en plantas never ripe aumentó la expresión de genes relacionados con etileno apuntando a una producción local de etileno (Solano et al. 2014), cómo la descrita en la interacción de las plantas con bacterias patógenas (van Loon et al. 2006), y sugiriendo que la plantas never ripe podrían reconocer a Bm como un microorganismo tipo patogénico. Sin embargo, se observó una regulación negativa de la señalización del etileno (Tieman et al. 2000), y la inoculación de Bm produjo una respuesta de estrés en plantas never ripe probablemente debido a un fallo en el reconocimiento (Zamioudis and Pieterse 2012), pero sin desencadenar completamente mecanismos de defensa que causan una reducción en el crecimiento de la planta. Actividad promotora del crecimiento vegetal de B. megaterium Los análisis transcriptómicos y proteómicos mostraron que la inoculación de Bm en plantas de tipo silvestre podría favorecer la interacción planta-bacteria y mejorar la capacidad antioxidante. Sin emabergo, la insensibilidad a etileno daña la interacción de la planta con Bm percibiéndolo como un microorganismo patogénico que aumenta el estrés oxidativo y dando lugar a una asociación que no es completamente funcional pero sin desencadenar completamente una respuesta inmune. Además, el análisis de los metabolitos de la raíz sugiere que la inoculación de Bm principalmente modifica el metabolismo de azúcares aumentando la supresión de la fotosíntesis causada por los niveles endógenos de glucosa en plantas never ripe (Paul and Pellny 2003). Por otro lado, los niveles reducidos de ácido fumárico (necesario para la formación del biofilm (Yuan et al. 2015)) en raíces never ripe inoculadas con Bm, y la competencia por el hierro propuesta en la rizosfera (Pii et al. 2015), también apoyan el fallo en la interacción funcional. La percepción de PGPB como un ligero estrés biótico ha sido descrita anteriormente (Timmusk and Wagner 1999) viéndose involucrado el etileno en este proceso (Hontzeas et al. 2004). En conformidad con lo anterior, el presente estudio apunta a la sensibilidad a etileno como regulador de la interacción de las plantas con B. megaterium. El análisis de metabolitos antioxidantes confirmó los resultados transcriptómicos y proteómicos mostrando que la inoculación de Bm aumentó los niveles de glutatión reducido (GSH) en plantas de tipo silvestre. Este mecanismo había sido descrito previamente por la inoculación de Sphingomonas sp. LK11 en tomate (Halo et al. 2015). Por ello, la actividad PGPB de B. megaterium propuesta como dependiente de la percepción de etileno a través de SlETR3 es mediada por niveles altos de glutatión reducido afectando al estado redox celular, y en consecuencia, a la capacidad antioxidante necesaria para mejorar la tolerancia frente a estreses. Sin embargo, la interacción entre B. megaterium y plantas never ripe no fue completamente establecida causando estrés oxidativo en las plantas insensibles a etileno. Actividad promotora del crecimiento vegetal de Enterobacter C7 Los análisis transcriptómicos y proteómicos mostraron que la sensibilidad a etileno también determina la interacción de las plantas con Enterobacter C7. La presencia de Enterobacter C7 en raíces de tipo silvestre causó un leve estrés, pero las plantas fueron capaces de reconocer a C7 minimizando la respuesta de defensa. Además, la inoculación de C7 en plantas never ripe podría mejorar la nutrición vegetal, contrarrestando los efectos de estrés, ya que las plantas never ripe atenúan la interacción con C7 modulando proteínas implicadas en su reconocimiento. La inoculación de C7 podría mejorar la eficiencia en el uso del nitrógeno y/o modular el metabolismo amino acídico independientemente de la sensibilidad a etileno, como se observó en los resultados de metabolitos y ha sido previamente descrito para varias PGPB (Mantelin and Touraine 2004; Carvalho et al. 2014). Además, el análisis de antioxidantes mostró que la inoculación de C7 aumenta el estrés oxidativo en ambos genotipos de planta a la vez que promueve el crecimiento vegetal indicando que el mecanismo de acción de Enterobacter C7 es independiente de la percepción del etileno y el estrés oxidativo. El análisis proteómico también sugirió que la nutrición de fósforo está implicada en el mecanismo de acción PGPB de C7 y que la percepción de etileno a través de SlETR3 determina la interacción planta-C7. La inoculación de C7 mejoró la nutrición de plantas de tipo silvestre y never ripe mediado por los transportadores de fosfato SlPT1 y SlPT2, respectivamente, evitando la respuesta de estrés por bajo fósforo y manteniendo el crecimiento de las plantas (Hermans et al. 2006). Por ello, Enterobacter C7 es capaz de promover el crecimiento vegetal mejorando la nutrición de fósforo y sorteando la insensibilidad a etileno a través de SlETR3 modulando dos transportadores de fosfato diferentes. Trabajo futuro Aunque los efectos de la inoculación de PGPB sobre la fisiología de las plantas representan una información útil para la aplicación en los sistemas de cultivo, es necesaria más investigación para elucidar completamente los mecanismos de acción de B. megaterium y Enterobacter C7, así como abordar otros posibles mecanismos de acción que puedan mejorar simultáneamente el crecimiento de las plantas (Martínez-Viveros et al. 2010). También los mecanismos de acción descritos deberían ser corroborados bajo condiciones de sequía. Además, la asociación beneficiosa entre plantas y PGPB requiere reconocimiento mutuo (Zamioudis and Pieterse 2012), y por ello la investigación de las características y fisiología bacterianas podría ayudar a esclarecer la interacción planta-bacteria. Por otra parte, el gen TCTR1 (Tomato Constitutive Triple Response 1) está implicado en la regulación negativa del etileno (Tieman et al. 2000), y podría participar en la respuesta inicial después de la inoculación de Bm. Por ello, se están obteniendo líneas transgénicas de silenciamiento y sobreexpresión de TCTR1 para evaluar el crecimiento de las plantas así como la interacción con B. megaterium. La utilización de PGPB se encuentra pobremente representada en la agricultura mundial (Banerjee et al. 2006; Timmusk 2017), pero un consorcio de microorganismos beneficiosos en combinación con la planta adecuada bajo determinadas condiciones ambientales podrá producir efectos positivos y reales dando lugar a una alternativa viable para la intensificación sostenible de la agricultura. Conclusiones • La percepción del etileno a través de SlETR3 es esencial para la actividad promotora del crecimiento vegetal de Bacillus megaterium en plantas de tomate, mientras que el mecanismo PGPB de Enterobacter C7 parecer ser independiente de SlETR3. • Los efectos de la inoculación de PGPB sobre la fisiología vegetal son específicos de la cepa bacteriana y dependientes de la sensibilidad a etileno así como de las condiciones de crecimiento de la planta. • La inoculación con PGPB afecta a la fotosíntesis, fitohormonas y metabolitos de la raíz en plantas juveniles predisponiendo a la plantas para el futuro crecimiento. • Ambas cepas bacterianas actúan como PGPB en condiciones de buen riego y sequía en plantas de tomate sensible al etileno dando lugar a una mejora en el estado fisiológico de la planta y mitigación del estrés. • La mutación de SlETR3 perjudica la interacción entre Bacillus megaterium y plantas de tomate never ripe, resultando en un reconocimiento no completamente funcional y causando un incremento del estrés oxidativo y la pérdida de la actividad promotora del crecimiento. • La actividad PGPB de Bacillus megaterium en plantas de tomate podría estar mediada por niveles altos de glutatión reducido, y por tanto por una mejora del estado antioxidante vegetal. • La mutación de SlETR3 determina la interacción de las plantas con Enterobacter C7, cuyo mecanismo PGPB implica la mejora de la nutrición de fósforo mediada por los transportadores de fosfato SlPT1 y SlPT2 en plantas de tipo silvestre y never ripe, respectivamente, evitando así la respuesta de estrés por bajo fósforo. Ethylene perception by ETR3 determines plant interaction with plant growth promoting bacteria in tomato (Solanum lycopersicum) Pablo Ibort Pereda Introduction The sustainable intensification of agriculture pursued to provide food security to an expanding global population and simultaneously reduce negative environmental impacts of agriculture (Tilman et al. 2011). Thus, new strategies should be developed to increase efficiency in crop resource utilization maintaining present yields (Dodd and Ruiz-Lozano 2012). Management of rhizospheric microorganisms is a valuable strategy to induce plant growth (Berg 2009; Singh et al. 2011), and could diminish chemicals inputs in agriculture (Bhattacharyya and Jha 2012). However, in-depth research is needed to completely understand interaction between plant and microorganisms as well as bacterial action mechanisms for the proper and effective large-scale use of these microorganisms in integrated agricultural systems (Berg 2009). Rhizospheric microorganisms are associated with nutrient biogeochemical cycles (Barea et al. 2005), and plant-bacteria interaction is essential for better nutrition (Ryan et al. 2009). Moreover, nutritional and hormonal homeostasis are closely coordinated to finely regulate plant growth and development (Krouk et al. 2011). Plant growth promoting bacteria (PGPB) can act either directly or indirectly (Ortíz-Castro et al. 2009), and several mechanisms involve modulation of ethylene levels. Ethylene is typically induced in response to environmental stresses as drought (Pierik et al. 2007), and some PGPB were defined as stress controllers (Lugtenberg and Kamilova 2009), since they contain 1-aminocyclopropane1-carboxylate deaminase (ACCd) activity and are able to reduce ethylene levels and thus diminish ethylene growth inhibitory effects (Abeles et al. 1992; Glick 2014). Recently, -omics have contributed to clarify plant-bacteria interaction, but further research is required since PGPB action mechanisms are often strain-specific (Long et al. 2008) and less well characterized (Pühler et al. 2004). Furthermore, roots are the bacterial niche where a direct plant-bacteria interaction occurs (Benizri et al. 2001). Transcriptomic and proteomic approaches as well as metabolic information have contributed with valuable information to clarify plant-bacteria interaction as well as to predict physiological changes (van de Mortel et al. 2012; Feussner and Polle 2015; Su et al. 2016). The present doctoral thesis mainly pursued to shed light on the interaction between two plant growth-promoting bacteria and tomato plants regarding ethylene sensitivity by using different approaches to clarify bacterial action mechanisms. In consequence, the ethylene-insensitive mutant never ripe (nr) (unable to perceive ethylene due to a mutation in the ethylene receptor SlETR3) (Lanahan et al. 1994; Wilkinson et al. 1995), and its isogenic wild-type (wt) parental Pearson cv. tomato (Solanum lycopersiucum) were selected in order to be inoculated with PGPB isolated from arid soils in shouthern Spain: Bacillus megaterium (Bm) (Marulanda-Aguirre et al. 2008) and Enterobacter sp. (hereinafter Enterobacter C7 (C7)). Since most studies about the role of ethylene in the PGPB activity have been focused on bacteria able to reduce ACC contents (Glick 2014), we intended to use bacteria without either ACC deaminase activity or ethylene production capacity to avoid any perturbation of plant ethylene metabolism. Chapter 1: Ethylene sensitivity by ETR3 is essential in tomato interaction with Bacillus megaterium but not with Enterobacter C7 The first chapter pursued to establish whether ethylene perception is critical for growth induction by two different PGPB strains, and to assess the bacterial effects on ethylene emission and gene expression in mature tomato plants. Never ripe and wild-type plants inoculated with either B. megaterium or Enterobacter C7 were grown until mature stage under well watered and drought conditions to analyze growth promotion, and bacterial inoculation effects on ethylene production, expression of ethylene-related genes and root transcriptomic profiles. Enterobacter C7 promoted growth independently of plant genotype, meanwhile Bm PGPB activity was noticed exclusively in wt plants. Moreover, both PGPB decreased expression of ethylene biosynthesis genes resulting in drought stress alleviation in wt plants. However, ethylene insensitivity compromised interaction with Bm which induced ethylene-related genes causing a mild biotic stress (Timmusk and Wagner 1999). PGPB inoculation affected transcriptomic profile dependently on strain, genotype and drought altering genes involved in oxidative stress response and metabolite accumulation together with phytohormonal and nutritional statutes. Thus, ethylene sensitivity is proposed as determinant for suitable interaction between PGPB and tomato. C7 could modulate amino acidic metabolism independently of ethylene perception. However, never ripe mutation causes non-completely functional interaction with Bm, resulting in higher oxidative stress and PGPB activity lost. Thereby, ethylene perception by SlETR3 is crucial for B. megaterium PGPB activity, but slightly affects Enterobacter C7 promotion effects. Chapter 2: PGPB inoculation modifies photosynthetic traits and root metabolites as well as nutritional and hormonal statuses with strong influence of ethylene sensitivity The present chapter aimed to establish whether ethylene perception is critical for plant-bacteria interaction and growth induction by both PGPB at juvenile stage, and to assess the physiological effects of these strains in juvenile and mature tomato plants. Never ripe and wild-type plants inoculated with either B. megaterium or Enterobacter C7 were grown until juvenile and mature stages, when biomass, stomatal conductance, photosynthetic traits as well as nutritional, hormonal and metabolic statuses were analyzed. No growth promotion was noticed in juvenile plants by any bacterium. However, Bm and C7 decreased and increased relative growth rate in nr plants, respectively. Furthermore, PGPB inoculation affected physiological parameters and root metabolite levels in juvenile plants, meanwhile plant nutrition was highly dependent on ethylene sensitivity and altered at the mature stage. Bm inoculation improved carbon assimilation in wt plants. However, insensitivity to ethylene compromised Bm PGPB activity affecting photosynthetic efficiency, plant nutrition and the root sugar content. Nevertheless, C7 inoculation modified the root amino acid content in addition to stomatal conductance and plant nutrition. Thereby, ethylene insensitivity determines plant interaction with PGPB, and severely impaired B. megaterium interaction with tomato plants, resulting in physiological modifications and loss of PGPB activity. In contrast, Enterobacter C7 inoculation stimulated growth independently of ethylene perception and could improve nitrogen assimilation in ethylene-insensitive plants. Chapter 3: Ethylene perception determines the outcome of plant-bacteria interaction resulting in reshaping of phosphorus nutrition and antioxidant status The present chapter aimed to shed light on plant-bacteria interaction and PGPB mechanisms regarding to ethylene perception using a proteomic approach. Never ripe and wild-type plants inoculated with either B.megaterium or Enterobacter C7 were grown until mature stage to analyze growth promotion, and bacterial inoculation effects on root microsomal proteomic profiles, which can contribute with valuable information regarding interaction, signalling and transport processes. Plant growth promotion results were in accordance with previous chapters. Moreover, PGPB inoculation affected proteomic profile in a strain- and genotype-dependent manner modifying levels of stress-related and interaction proteins, and showing bacterial inoculation effects on antioxidant status and phosphorus acquisition capacity. Indeed, antioxidant and phosphorus nutrition statuses were evaluated and a bioassay under low phosphorus conditions was performed based on proteomic results. Bm increased and decreased antioxidant capacity in wt and nr plants, respectively, while C7 increase oxidative stress in both plant genotypes. Thus, ethylene perception is essential for properly recognition of B. megaterium and growth promotion mediated in part by increased levels of reduced glutathione enhancing antioxidant capacity. In contrast, Enterobacter C7 is able to improve phosphorus nutrition independently of ethylene sensitivity, modulating the stress response induced by low phosphorus and keeping plant on growth. General Discussion PGPB inoculation modified nutritional, transcriptomic, metabolic and proteomic profiles in a strain-specific manner and dependently on ethylene sensitivity in accordance with strain-specific interactions between host-plants and bacterial strains (Walker et al. 2011; Weston et al. 2012) as well as strain-specific PGPB mechanisms and bacterial effects depending on plant growth conditions (Ryu et al. 2005; Long et al. 2008). PGPB inoculation directly modified root metabolites including amino acids, sugars and organic acids as previously reported (Weston et al. 2012; Su et al. 2016), that could explain plant growth promotion as well as plant-bacteria interaction. Furthemore, ethylene insensitivity caused higher differences than PGPB inoculation since ethylene is involved in several key processes in plant physiology and phenotypic plasticity (Dugardeyn and Van Der Straeten 2008). The present study report for first time an ethylene-dependent mechanism in bacteria without ACC deaminase activity. Both Bm and C7 were able to colonize the roots, which is a determinant for interaction with plants (Benizri et al. 2001), independently of ethylene-sensitivity. However, ethylene perception by SlETR3 is proposed as essential for growth promotion mediated by Bm but no for C7. Indeed, ethylene sensitivity determines plant interaction with both PGPB strains. Moreover, PGPB improved their efficiency in wt plants under drought conditions suggesting stress alleviation as previously reported (Aroca and Ruiz-Lozano 2009), and enhancement of resource use efficiency (Dodd and Ruiz-Lozano 2012). Phytohormone analysis showed that C7 inoculation modulates root ABA in juvenile nr plants suppressing plant response mediated by SA and/or JA/ethylene (Anderson et al. 2004; Sánchez-Vallet et al. 2012). In contrast, endogenous ABA levels could be essential for growth promotion mediated by Bm maintaining production of ethylene at low levels (Porcel et al. 2014). Increased levels of SA, JA and JA-Ile under Bm inoculation in nr plants regarding wt ones suggested that Bm activate defenses in nr plants (Browse 2009; Vlot et al. 2009). All these bacterial effects in juvenile plants predispose plants for further growth since there is a balance between plant growth and defense which implies antagonistic crosstalk among phytohormones (Karasov et al. 2017). B. megaterium inoculation in nr plants increased expression of ethylene-related genes pointing to a local ethylene production (Solano et al. 2014) as reported in plant interaction with bacterial pathogens (van Loon et al. 2006), and suggesting that nr plants could recognize Bm as a pathogen-like microorganism. However, ethylene negatively feedback regulation was observed (Tieman et al. 2000), and thereby Bm inoculation induced a stress response in nr plants probably due to a miss-recognition (Zamioudis and Pieterse 2012), but not completely trigger defense mechanisms causing plant growth reduction. Bacillus megaterium PGPB activity Transcriptomic and proteomic analyses showed that Bm inoculation in wt plants could result in improved antioxidant capacity and favored interaction, while ethylene insensitivity impairs interaction with Bm resulting in its perception as a pathogenic-like bacteria increasing the oxidative stress and establishing a non-completely functional association, but without fully triggering immune response. Root metabolites analysis suggests that Bm inoculation mainly modify sugar metabolism enhancing photosynthesis suppression by endogenous glucose levels in nr plants (Paul and Pellny 2003). Furthermore, reduced levels in nr roots under Bm inoculation of fumaric acid (necessary for biofilm formation (Yuan et al. 2015)), and competition for iron at the rhizosphere (Pii et al. 2015) also supported a failure in functional interaction. PGPB perception as mild biotic stress was previously reported (Timmusk and Wagner 1999) and ethylene was involved in this process (Hontzeas et al. 2004). In accordance, the present study points to ethylene sensitivity as regulator of plant interaction with PGPB. Antioxidant metabolite results confirmed transcriptomic and proteomic results showing that Bm increased reduced glutathione (GSH) levels in wt plants as previously reported by Sphingomonas sp. LK11 in tomato (Halo et al. 2015). Thus, Bm PGPB activity proposed as dependent on ethylene perception by SlETR3 is mediated by increased GSH levels affecting cellular redox status, and thereby antioxidant capacity necessary to improve stress tolerance. However, Bm interaction with nr plants was not completely successful and causes oxidative stress. Enterobacter C7 PGPB activity Transcriptomic and proteomic analyses showed that ethylene sensitivity determines plant interaction with C7 affecting different processes. C7 presence in wt roots caused slight stress, but wt plants were able to recognize C7 minimizing defense response. Moreover, C7 inoculation in nr plants could improve plant fitness enhancing plant nutrition and counteracting stress effects since nr plants tempers C7 interaction modulating recognition-related proteins. C7 could enhance the nitrogen use efficiency and/or modulate amino acidic metabolism independently of ethylene sensitivity as observed in metabolite results, and previously reported by several PGPB (Mantelin and Touraine 2004; Carvalho et al. 2014). Moreover, antioxidant analysis showed that C7 inoculation increases oxidative stress in both plant genotypes together with plant growth promotion pointing that C7 action mechanism is independent of ethylene perception and oxidative stress. Proteomic analysis also suggested that phosphorus nutrition is involved in C7 PGPB mechanism and ethylene perception by SlETR3 determines plant-C7 interaction. C7 inoculation improved phosphorus nutrition in wt and nr plants mediated by phosphate transporters SlPT1 and SlPT2, respectively, avoiding low phosphorus stress response and keeping plants on growth (Hermans et al. 2006). Thus, C7 is able to promote plant growth independently on ethylene sensitivity improving phosphorus nutrition and circumventing ethylene insensitivity by SlETR3 modulating two different phosphate transporters. Future work Although PGPB inoculation effects on plant physiology represent valuable information for application in crop systems, further research is needed to completely elucidate Bm and C7 action mechanisms as well as address other possible action mechanisms, which simultaneously improve plant growth (Martínez-Viveros et al. 2010). Also, described action mechanism should be corroborated under drought conditions. Moreover, beneficial association between plants and PGPB requires mutual recognition (Zamioudis and Pieterse 2012), and thereby direct research addressing bacterial features and physiology can help to clarify plant-bacteria interaction. Furthermore, TCTR1 is involved in ethylene negatively feedback regulation (Tieman et al. 2000), and could participate in initial response after Bm inoculation. Thus, transgenic lines silencing and overexpressing TCTR1 are being obtained to assay plant growth and interaction with B. megaterium. PGPB utilization is poorly represented in worldwide agriculture (Banerjee et al. 2006; Timmusk 2017), but a beneficial microorganisms consortia in combination with the right plant under certain environmental conditions will be able to produce real and positive effects resulting in a feasible option for sustainable intensification of agriculture. Conclusions • Ethylene perception by ETR3 is essential for PGPB activity of Bacillus megaterium in tomato plants, whereas Enterobacter C7 PGPB mechanism seems to be ETR3-independent. • PGPB inoculation effects on plant physiology are strain-specific and dependent on plant ethylene sensitivity as well as on plant growth conditions. • PGPB inoculation affects photosynthesis, phythormones and root metabolites in juvenile plants predisposing plants for further growth. • Both bacterial strains acts as PGPB under well watered and drought conditions in ethylene-sensitive tomato plants resulting in improved plant fitness and stress alleviation. • ETR3 mutation impairs interaction between Bm and tomato never ripe plants, resulting in a non-completely functional recognition and leading to increased oxidative stress and loss of PGPB activity. • PGPB activity of Bacillus megaterium in tomato plants could be proposed as mediated by increased GSH and thereby improving the plant redox status. • ETR3 mutation determines plant interaction with Enterobacter C7, whose PGPB mechanism implies phosphorus nutrition enhancement mediated by SlPT1 and SlPT2 in wt and nr plants, respectively, and avoidance of low phosphorus stress response. References Abeles FB, Morgan PW, Saltveit ME. 1992. Ethylene in Plant Biology. Ethylene in Plant Biology: 264–296. Anderson JP, Badruzsaufari E, Schenk PM, et al. 2004. Antagonistic Interaction between Abscisic Acid and Jasmonate-Ethylene Signaling Pathways Modulates Defense Gene Expression and Disease Resistance in Arabidopsis. The Plant Cell 16: 3460–3479. Aroca R, Ruiz-Lozano JM. 2009. Induction of plant tolerance to semi-arid enviroments by beneficial soil microorganisms. A review (E Lichtfouse, Ed.). Climate Change, Intercropping, Pest Control and Beneficial Microorganisms, Sustainable Agriculture Reviews: 121–35. Banerjee MR, Yesmin L, Vessey JK. 2006. Plant-growth-promoting rhizobacteria as biofertilizers and biopesticides. In: Handbook of Microbial Biofertilizers.137–183. Barea JM, Pozo MJ, Azcón R, Azcón-Aguilar C. 2005. Microbial co-operation in the rhizosphere. Journal of Experimental Botany 56: 1761–1778. Benizri E, Baudoin E, Guckert A. 2001. Root colonization by inoculated plant growth-promoting rhizobacteria. Biocontrol Science and Technology 11: 557–574. Berg G. 2009. Plant–microbe interactions promoting plant growth and health: perspectives for controlled use of microorganisms in agriculture. Applied Microbiology and Biotechnology 84: 11–18. Bhattacharyya PN, Jha DK. 2012. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World journal of microbiology & biotechnology 28: 1327–50. Browse J. 2009. Jasmonate passes muster: a receptor and targets for the defense hormone. Annual review of plant biology 60: 183–205. Carvalho TLG, Balsemao-Pires E, Saraiva RM, Ferreira PCG, Hemerly AS. 2014. Nitrogen signalling in plant interactions with associative and endophytic diazotrophic bacteria. Journal of Experimental Botany 65: 5631–5642. Dodd IC, Ruiz-Lozano JM. 2012. Microbial enhancement of crop resource use efficiency. Current Opinion in Biotechnology 23: 236–42. Dugardeyn J, Van Der Straeten D. 2008. Ethylene: Fine-tuning plant growth and development by stimulation and inhibition of elongation. Plant Science 175: 59–70. Feussner I, Polle A. 2015. What the transcriptome does not tell - proteomics and metabolomics are closer to the plants’ patho-phenotype. Current Opinion in Plant Biology 26: 26–31. Glick BR. 2014. Bacteria with ACC deaminase can promote plant growth and help to feed the world. Microbiological Research 169: 30–39. Halo BA, Khan AL, Waqas M, et al. 2015. Endophytic bacteria ( Sphingomonas sp. LK11) and gibberellin can improve Solanum lycopersicum growth and oxidative stress under salinity. Journal of Plant Interactions 10: 117–125. Hermans C, Hammond JP, White PJ, Verbruggen N. 2006. How do plants respond to nutrient shortage by biomass allocation? Trends in Plant Science 11: 610–617. Hontzeas N, Saleh SS, Glick BR. 2004. Changes in gene expression in canola roots induced by ACC-deaminase-containing plant-growth-promoting bacteria. Molecular plant-microbe interactions : MPMI 17: 865–871. Karasov T, Chae E, Herman J, Bergelson J. 2017. Mechanisms to Mitigate the Tradeoff between Growth and Defense. The Plant Cell: tpc.00931.2016. Krouk G, Ruffel S, Gutiérrez RA, et al. 2011. A framework integrating plant growth with hormones and nutrients. Trends in Plant Science 16: 178–182. Lanahan MB, Yen HC, Giovannoni JJ, Klee HJ. 1994. The never ripe mutation blocks ethylene perception in tomato. The Plant cell 6: 521–30. Long HH, Schmidt DD, Baldwin IT. 2008. Native bacterial endophytes promote host growth in a species-specific manner; phytohormone manipulations do not result in common growth responses. PLoS ONE 3. van Loon LC, Geraats BPJ, Linthorst HJM. 2006. Ethylene as a modulator of disease resistance in plants. Trends in Plant Science 11: 184–191. Lugtenberg B, Kamilova F. 2009. Plant-growth-promoting rhizobacteria. Annual Review of Microbiology 63: 541–56. Mantelin S, Touraine B. 2004. Plant growth-promoting bacteria and nitrate availability: Impacts on root development and nitrate uptake. Journal of Experimental Botany 55: 27–34. Martínez-Viveros O, Jorquera M., Crowley D., Gajardo G, Mora M. 2010. Mechanisms and practical considerations involved in plant growth promotion by rhizobacteria. Journal of Soil Science and Plant Nutrition 10: 293–319. Marulanda-Aguirre A, Azcón R, Ruiz-Lozano JM, Aroca R. 2008. Differential effects of a Bacillus megaterium strain on Lactuca sativa plant growth depending on the origin of the arbuscular mycorrhizal fungus coinoculated: physiologic and biochemical traits. Journal of Plant Growth Regulation 27: 10–8. van de Mortel JE, de Vos RCH, Dekkers E, et al. 2012. Metabolic and transcriptomic changes induced in Arabidopsis by the rhizobacterium Pseudomonas fluorescens SS101. Plant Physiology 160: 2173–2188. Ortíz-Castro R, Contreras-Cornejo HA, Macías-Rodríguez L, López-Bucio J. 2009. The role of microbial signals in plant growth and development. Plant Signaling & Behavior 4: 701–712. Paul MJ, Pellny TK. 2003. Carbon metabolite feedback regulation of leaf photosynthesis and development. Journal of Experimental Botany 54: 539–547. Pierik R, Sasidharan R, Voesenek LACJ. 2007. Growth control by ethylene: Adjusting phenotypes to the environment. Journal of Plant Growth Regulation 26: 188–200. Pii Y, Mimmo T, Tomasi N, Terzano R, Cesco S, Crecchio C. 2015. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils 51: 403–415. Porcel R, Zamarreño ÁM, García-Mina JM, Aroca R. 2014. Involvement of plant endogenous ABA in Bacillus megaterium PGPR activity in tomato plants. BMC Plant Biology 14: 36. Pühler A, Arlat M, Becker A, Göttfert M, Morrissey JP, O’Gara F. 2004. What can bacterial genome research teach us about bacteria–plant interactions? Current Opinion in Plant Biology 7: 137–147. Ryan PR, Dessaux Y, Thomashow LS, Weller DM. 2009. Rhizosphere engineering and management for sustainable agriculture. Plant and Soil 321: 363–383. Ryu C-M, Hu C-H, Locy RD, Kloepper JW. 2005. Study of mechanisms for plant growth promotion elicited by rhizobacteria in Arabidopsis thaliana. Plant and Soil 268: 285–292. Sánchez-Vallet A, López G, Ramos B, et al. 2012. Disruption of abscisic acid signaling constitutively activates Arabidopsis resistance to the necrotrophic fungus Plectosphaerella cucumerina. Plant physiology 160: 2109–24. Singh JS, Pandey VC, Singh DP. 2011. Efficient soil microorganisms: a new dimension for sustainable agriculture and environmental development. Agriculture, Ecosystems and Environment 140: 339–353. Solano R, Stepanova AN, Chao Q, et al. 2014. Ethylene in Plants In: The Plant cell.234–234. Su F, Gilard F, Guerard F, et al. 2016. Spatio-temporal responses of Arabidopsis leaves in photosynthetic performance and metabolite contents to Burkholderia phytofirmans PsJN. Frontiers in Plant Science 7: 1–15. Tieman DM, Taylor MG, Ciardi J a, Klee HJ. 2000. The tomato ethylene receptors NR and LeETR4 are negative regulators of ethylene response and exhibit functional compensation within a multigene family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97: 5663–8. Tilman D, Balzer C, Hill J, Befort BL. 2011. Global food demand and the sustainable intensification of agriculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108: 20260–4. Timmusk S. 2017. Perspectives and Challenges of Microbial Application for Crop Improvement. Frontiers in Plant Science 8: 49. Timmusk S, Wagner EG. 1999. The plant-growth-promoting rhizobacterium Paenibacillus polymyxa induces changes in Arabidopsis thaliana gene expression: a possible connection between biotic and abiotic stress responses. Molecular plant-microbe interactions : MPMI 12: 951–959. Vlot AC, Dempsey DA, Klessig DF. 2009. Salicylic Acid, a Multifaceted Hormone to Combat Disease. Annual Review of Phytopathology 47: 177–206. Walker V, Bertrand C, Bellvert F, Moënne-Loccoz Y, Bally R, Comte G. 2011. Host plant secondary metabolite profiling shows a complex, strain-dependent response of maize to plant growth-promoting rhizobacteria of the genus Azospirillum. New Phytologist 189: 494–506. Weston DJ, Pelletier D a., Morrell-Falvey JL, et al. 2012. Pseudomonas fluorescen induces strain-dependent and strain-independent host plant responses in defense networks, primary metabolism, photosynthesis, and fitness. Molecular Plant-Microbe Interactions 25: 765–778. Wilkinson JQ, Lanahan MB, Yen HC, Giovannoni JJ, Klee HJ. 1995. An ethylene-inducible component of signal transduction encoded by never-ripe. Science 270: 1807–1809. Yuan J, Zhang N, Huang Q, et al. 2015. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports 5: 13438. Zamioudis C, Pieterse CMJ. 2012. Modulation of Host Immunity by Beneficial Microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions 25: 139–150.