Actividad anti-anisakis de diversos compuestos, epidemiología molecular y nuevos métodos de identificación de las especies hermanas A. Simplex S.S. y A. Pegreffii

Resumen

La anisakiasis es una infección accidental del tracto gastrointestinal (GI) humano por anisákidos, que puede causar síntomas clínicos agudos, los cuales se alivian mediante la extracción de las larvas cuando se encuentran en zonas accesibles del tracto GI. Se han propuesto varios tratamientos con el objetivo de evitar la intervención quirúrgica, utilizándose los inhibidores de la bomba de protones para disminuir la inflamación y epigastralgia. Por otro lado, se ha relacionado una edad superior a 60 años con una menor incidencia de casos de anisakiasis, circunstancia que podría estar justificada por el aumento de pH gástrico en estas edades, teniendo en cuenta que el desarrollo de la larva está favorecido por el pH ácido del medio. Estas premisas nos han llevado a explorar la posibilidad de que el aumento del pH gástrico, tras la administración de distintos antiácidos, fuera eficaz en el tratamiento de esta parasitosis. Los fármacos antiácidos elegidos fueron los inhibidores de la secreción ácida, omeprazol (3,6 mg/kg, a los animales en ayuno de 4-6 h) y ranitidina (27 mg/kg), y un protector de la mucosa gástrica, sucralfato (90 mg/kg); todos se administraron 30 min antes de la infección con seis larvas. Como fármacos de referencia se emplearon los antihelmínticos mebendazol y flubendazol, ambos a la dosis de 45 mg/kg al mismo tiempo que la infección. Cada uno de los ensayos estuvo constituido por lotes de 20 ratas Wistar, a las que se administró una sola dosis de cada fármaco mediante sonda gástrica. Adicionalmente, se realizó un tratamiento de larga duración (TLD) con omeprazol, ranitidina y sucralfato; estos medicamentos se administraron durante 14 días consecutivos, practicando la infección el día 15. Previamente, se habían realizado ensayos in vitro de los antiácidos, 0,5 y 2,5 mg/ml en NaCl 0,9%, añadiendo 2 ml a cada pocillo de la placa de poliestireno con una larva de Anisakis (procedente de pescado del mar Cantábrico), y tras 48 h se constató su inactividad frente a las L3s. Los resultados obtenidos de la necropsia y apertura del tracto GI de los animales después de 4 h post-infección, mostraron porcentajes de lesiones elevados al tratar a los animales infectados con una sola dosis de omeprazol, ranitidina y sucralfato, alcanzándose en el caso de omeprazol y sucralfato, el 75 y 65%, sin diferencias estadísticamente significativas con respecto al lote control. La ranitidina propició unas condiciones del medio gástrico menos favorables para el parásito, encontrando un menor porcentaje de larvas en la luz del estómago y sin aparición de lesiones múltiples (35% de lesiones individuales). Sin embargo, el pH gástrico de los animales tratados con omeprazol y ranitidina fue similar (pH medio= 5). El TLD resultó en una ligera disminución del % de animales con lesión respecto a una sola dosis de omeprazol y ranitidina, y también se redujo el tamaño de las lesiones, principalmente con el omeprazol. Al igual que con una dosis, el TLD con el sucralfato dio lugar a un elevado % de larvas en la luz gástrica; esta permanencia en el estómago habría facilitado la fijación de un mayor número de larvas a la mucosa (48,15%), aunque la viscosidad del fármaco pudo dificultar su penetración en capas más profundas, conduciendo a un mayor % de lesiones más superficiales de tipo puntual (80%). En nuestro trabajo, solo el tratamiento con mebendazol resultó significativo en la reducción de animales infectados (35%; p= 0,003); la eficacia pudo haberse reducido debido a que algunas larvas pudieron ocultarse entre los pliegues internos de la mucosa, escapando al efecto antihelmíntico. En cuanto al tamaño de las lesiones provocadas por las larvas, más del 50 % tuvo un tamaño superior a 3 mm. El examen histológico del estómago lesionado de las ratas, no mostró diferencias entre las alteraciones histológicas de las muestras de los animales tratados, según la mayoría de los autores, y las de aquellos que no recibieron tratamiento farmacológico. Los daños producidos por la larva adherida a la mucosa, concuerdan, según la mayoría de los autores, con los observados en la infección temprana en humanos. El sitio de penetración de la larva en el estómago se produjo con mayor frecuencia en la zona glandular del estómago. A día de hoy no se dispone de ningún fármaco realmente eficaz frente a la anisakiasis. En la búsqueda de nuevos antihelmínticos, las enzimas cisteín-proteinasas de algunas plantas han sido objeto de estudio por diferentes autores, causando daños severos en la cutícula de los nematodos (Stepek et al. 2005, 2007b; Luoga et al. 2015). Ello ha derivado en la realización, por nuestra parte, de ensayos de viabilidad y eficacia frente Anisakis, de la papaína y la bromelaína, dos de las enzimas vegetales más estudiadas, con propiedades antiinflamatorias conocidas y baja toxicidad (Salas et al. 2008). Se utilizaron papaína (aislada de polvo liofilizado de látex de papaya 3,36 U/mg proteína), y bromelaína (aislada de polvo liofilizado de tallo de piña 6 U/mg), ambas adquiridas de Sigma-Aldrich® (St. Louis, MO, USA). Para los ensayos in vitro con extracto de papaína se eligieron las concentraciones de 0,05, 0,025 y 0,0025 g/ml en NaCl 0,9%, y para el de bromelaína, 0,025 g/ml. A esta concentración (0,025 g/ml), el efecto larvicida de la papaína fue del 100%, mientras que el de la bromelaína fue mucho menor (31,67%). La actividad mostrada por la papaína fue tiempo-dependiente, incrementándose hasta obtener el 100% a las 48 h. El resultado de su actuación es interesante, ya que provoca una desestructuración y fragmentación de las larvas, que, de este modo, van perdiendo movilidad hasta su muerte, considerándose el criterio de integridad (larvas fragmentadas) para la determinación de su inviabilidad. Si consideramos la eficacia larvicida de la bromelaína en nuestro estudio, ésta ha dado lugar a la inviabilidad de menos del 50% de las larvas; sin embargo, al igual que la anterior, el efecto anisakicida ocurre con fragmentación y desintegración cuticular mediante la digestión de las proteínas tisulares. Otros autores habían referido un tiempo menor de exposición a otros nematodos para la aparición de daño cuticular utilizando ambas cisteinasas (Stepek et al. 2005, 2007; Luoga et al. 2015). La diferencia de eficacia hallada en la actividad larvicida de las dos enzimas papaína y bromelaína, ensayadas a las mismas concentraciones, podría residir en las moléculas diana de la cutícula de los parásitos; así, estas proteinasas tendrían diferente especifidad de substrato y por tanto, se unirían con mayor o menor restricción a las secuencias peptídicas de las proteínas de la cutícula, con el fin de hidrolizar a un mayor o menor número de uniones (Luoga et al. 2015). Los ensayos in vivo llevados a cabo con el extracto de papaína (0,08 g/kg), administrado junto con seis L3 de Anisakis vía oral, dieron lugar a un 50% de animales con lesiones presentes en la zona muscular del estómago, una puntual (1,5 x 1,5 mm), una de 5 x 2 mm, y otra de 6 x 2 mm; además, las larvas recuperadas de la necropsia no mostraron daños estructurales ni signos de inacción. La baja eficacia pudo deberse a que la papaína es inestable a pH ácido, un obstáculo en nuestro estudio donde los animales tenían un pH gástrico de 4. En este sentido, otros estudios previos reportaron un incremento de la eficacia frente al nematodo estomacal Protospirura muricola cuando las enzimas se combinaron con cimetidina (Stepek et al. 2007). Siguiendo la línea de investigación de productos naturales frente a Anisakis, nos centramos en la granada (Punica granatum), una planta cuyo fruto ha adquirido importancia en la preparación de zumos frescos y bebidas enlatadas, entre otros (Fadavi et al. 2005). Es conocida su actividad antiinflamatoria, antibacteriana y antiulcerosa, parcialmente justificada por su efecto antioxidante (Lansky et al. 2007; Jasuja et al. 2012) y la utilización del extracto de la fruta y/o de sus partes como antiparasitario, frente a protozoos, cestodos, trematodos y nematodos (Dell’Agli et al. 2009; Abdel-Ghaffar et al. 2010; Dkhil 2013). En el estudio, se utilizan dos tipos de productos: granadas (variedad Mollar Elche) y zumo 100% de granada (Granatum plus®, Antioxidantes Naturales del Mediterráneo S. L.). Los ensayos se realizaron usando el extracto puro de la fruta (zumo y arilos) más el pericarpio, y de la fruta solamente, y directamente del envase, el zumo industrial de la fruta. El extracto del zumo, semillas y pericarpio preparado en el laboratorio, provocó mayor alteración de la integridad de las larvas que el extracto de los arilos solo; este efecto se observó en el primer tiempo de exposición, a las 24 h. Las muestras tanto frescas como las que habían sido previamente congeladas ejercieron la misma actividad, sin diferencias evidentes. Podría ocurrir que cuando se utilizaron varias fracciones de la planta, sus constituyentes actuaran de forma sinérgica. De hecho, tanto el zumo de los arilos, las semillas y el pericarpio son ricos en ácidos grasos (ácido punícico) y compuestos fenólicos con conocida acción antioxidante, principalmente en elagitaninos, punicalagina y punicalina, ácidos gálico y elágico, antocinaninas como cianidina, y flavonoides como catequina y quercetina (Jasuja et al. 2012). El zumo de granada embotellado no produjo ningún cambio en la movilidad y morfología de los parásitos. Por tanto, a pesar de tener capacidad antioxidante y reducir la lipoperoxidación gracias a su contenido en polifenoles (Jasuja et al. 2012), este producto no tiene efecto anisakicida. Otros productos naturales que han suscitado interés como agentes biocidas son los aceites esenciales (AEs) y sus principales componentes, algunos de los cuales han sido activos in vitro frente a larvas de Anisakis (Valero et al. 2015); estos hechos permiten suponer la posible actuación de determinadas esencias sobre dichas larvas. Algunos de ellos podrían constituir una alternativa al proceso de congelación del pescado, el cual afecta a las características organolépticas del mismo, y/o a la elevada duración de los procesos de marinado tradicionales. Por ello, los siguientes AEs se ensayaron al 5% (v/v) en aceite de oliva frente a las larvas L3 de Anisakis presentes en la musculatura de la bacaladilla: cantueso (Lavandula stoechas), comino (Cuminun cyminum), espliego (Lavandula spica), mejorana (Origanum marjorana), orégano (Origanum vulgaris), romero (Rosmarinus officinalis) y tomillo (Thymus vulgaris). Estos productos fueron suministrados por Sensient Fragrances (Granada, España), y se analizó su composición cuali-cuantitativa mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). Todos los AEs testados en nuestras experiencias promovieron la salida de las L3 presentes en la musculatura del pescado, de tal forma que en un alto porcentaje abandonaron esta localización para migrar al contenido del recipiente; los valores alcanzados son ≥ al 70% en el caso de los AEs de espliego, cantueso, mejorana, comino, y romero, e inferiores para el de orégano (60,78%). Este hecho no está exento de interés, puesto que la musculatura es la parte del pescado que ingiere el hombre. En este proceso se produce la muerte de un determinado número de larvas presentes en el pez, o la pérdida espontánea de movilidad al ponerse en contacto con los AEs. Así, en las larvas que permanecieron vivas se observó una disminución del movimiento espontáneo, que fue máxima (65,82%) para las larvas tratadas con el AE de comino, mínima (12,28%) para el de cantueso, y nula para la mejorana y el romero; resultados intermedios se obtuvieron con el del tomillo (53,40%), espliego (31,74%) y orégano (31,37%). Respecto a la actividad larvicida, los AEs que tuvieron una actuación más eficaz frente a las larvas de Anisakis fueron el de comino y orégano con los que sólo un 13,92% y 14,70% de las larvas, respectivamente, exhibieron un movimiento espontáneo; los buenos resultados obtenidos con estos dos AEs se encuentran en consonancia con los descritos por Valero et al (2006). El análisis GC-MS de AE de comino reveló la presencia de sus principales componentes: cuminaldehído (34,1%), 2 - caren - 10 - al (20,8%), p- cimeno (12,3%) y 3 - caren - 10 - al (11,8%); en el aceite de orégano se detectó carvacrol en una proporción alta (88,4%), mientras el p-cimeno (3,3%) y aromadendreno (2,4%) se encontraron en baja proporción. Los principales compuestos constituyentes han sido identificados en otros estudios de ambos AEs, mostrando actividad inhibitoria frente a ciertos agentes patógenos (Martínez-Velázquez et al. 2011; Kedia et al. 2014; Fournomiti et al. 2015). En otro estudio, el aceite especiado con comino provocó la muerte de las larvas de Anisakis en el interior del pescado después de cinco días de marinado (Trabelsi et al. 2018). El AE de tomillo exhibió menos actividad anti-anisakis: sólo logró la muerte del 11,4% de larvas, pero un alto porcentaje de las larvas (53,4%) necesitó estímulo para moverse; este AE estuvo compuesto por timol (76,3%), p-cimeno (17,7%), carvacrol (2,4%) y linalol (1,4%). Los monoterpenos fenólicos isoméricos, timol y carvacrol se comportaron como los constituyentes más activos, los cuales son responsables de una extensa actividad antimicrobiana y antihelmíntica (Hierro et al. 2004; di Pasqua et al. 2005; Fournomiti et al. 2015; Trailovic et al. 2015; López et al. 2017). El resto de los AEs no mostraron actividad biocida contra las L3s. Nuestros resultados refieren diferentes tasas de movilidad y mortalidad de las larvas del recipiente y de la musculatura, mostrando mayor pérdida de movilidad aquellas que migraron al recipiente; esto sería una consecuencia, posiblemente, de una mayor acción antiparasitaria del AE cuando las larvas se encuentran libres en contacto directo con el marinado, ofreciendo el músculo del pescado una protección natural a los parásitos (Sánchez-Monsálvez et al. 2005, Trabelsi et al. 2018). Respecto a los ensayos in vivo, se infectaron 44 ratas, cada una con 4 - 8 larvas activas, según el caso, junto con 0,5 ml de agua. Se diferenciaron dos lotes de animales, uno se infectó con las larvas vivas que habían abandonado la musculatura durante el tiempo de permanencia/inmersión en cada uno de los AEs, y el otro con las larvas recuperadas del pescado tratado y posterior digestión del mismo. La actuación de los AEs de orégano, el comino y cantueso sobre las L3 presentes en la musculatura del pescado fue tal, que dichas larvas no causaron ninguna lesión en el aparato digestivo de los animales. Con respecto a la acción del AE del cantueso, debemos señalar que, aunque no mostró acción larvicida in vitro, en los ensayos in vivo no se observaron lesiones en los animales infectados con larvas tratadas con este AE. La composición química de este aceite fue: fenchona (48,7%), alcanfor (40,0%) y 1,8-cineol (5,2%), por lo que dicho AE podría considerarse un quimiotipo alcanfor-fenchona. Teniendo en cuenta la alta cantidad de fenchona detectada en nuestro AE, la diferencia de actividad entre los ensayos in vitro e in vivo para este AE puede estar relacionada con una posible conversión, facilitada por el pH gástrico, de fenchona en su derivado alcohólico, fenchol, un compuesto que ha demostrado ser eficaz contra bacterias G+ y G-, así como contra diversos hongos (Kotan et al. 2007; Guleria et al. 2013). También debe destacarse que en el caso de las larvas tratado con el AE de mejorana, aunque se encontró una larva en la cavidad corporal del animal, no había signos visibles de lesiones en el tracto digestivo. Esto nos lleva a especular que este AE, cuyo componente principal es 1,8-cineol (68,1%), podría haber favorecido la reabsorción de la hemorragia. De igual modo, la actuación frente a la inflamación gástrica de otro grupo de productos naturales tales como las saponinas, sugiere la posibilidad de que estos compuestos muestren un efecto positivo en el proceso inflamatorio característico de la anisakiasis, teniendo también en cuenta que, según algunos autores, pueden alterar los procesos biológicos de algunos nematodos (Pérez-Pérez et al. 2014). Las sapogeninas seleccionadas para nuestros ensayos fueron diosgenina (95% pureza), ácido 18-β glicirretínico (97% pureza) y sarsasapogenina (98% pureza), adquiridas en Sigma®. Las pruebas in vitro no permitieron la observación de los parásitos debido a la turbidez del medio. Para evaluar su actividad in vivo se eligieron las dosis de 5 y 2,5 mg/kg de peso corporal para diosgenina se eligieron para evaluar su actividad (Matsuda et al., 2003). En el caso de la sarsapogenina y el ácido glicirretínico, se probaron 5 mg/kg y la fracción de 1/16 de la DL50 (DL50= 980 mg/kg para la primera y 2450 mg/kg para la segunda) (Hu et al. 2055; Kalaiarasi and Pugalendi 2009). Las tres sapogeninas se disolvieron en aceite de oliva y 1% de alcohol 96ᐤ, en condiciones de calor sin llegar a ebullición y agitación magnética, y se ensayaron in vivo, administrando simultáneamente seis larvas y 0,5 ml de cada solución de saponina a lotes de 20 animales cada uno, procediendo 4 h después a la necropsia, apertura del tracto GI y examen bajo el microscopio estereoscópico. La diosgenina, a la dosis de 5 mg/kg fue la que presentó mayor actividad frente a Anisakis, ya que fue capaz de reducir el número de lesiones en los roedores en un 90% respecto al control; por ello, el análisis univalente muestra asociación entre el tratamiento de los animales con dicha saponina y la ausencia de lesiones (p< 0,001). Esta misma asociación se encontró para la variable fijación y/o penetración en la cavidad abdominal. La infiltración de células del sistema inmune observada en el estudio histológico de las ratas tratadas y la menor respuesta inflamatoria ante la agresión del parásito, podría ser debida, al menos en parte, al efecto modulador de la respuesta inmunológica y a la actividad antiinflamatoria de la diosgenina (Lee et al. 2010; Jesus et al. 2016). Respecto al tratamiento con la sarsasapogenina y ácido glicirretínico a dosis de 5 mg/kg, si bien ambas reducen el número de lesiones frente al control en un 40% y 50%, respectivamente, hay que indicar que sólo en el caso del ácido glicirretínico hubo asociación con las variables estudiadas (ausencia de lesión p< 0,008; no fijación o penetración en cavidad corporal p< 0,001). Sin embargo, la administración de estos productos a dosis mayores, (sarsapogenina a 61,25 mg/kg y ácido glicirretínico a 153,12 mg/kg), redujo 2,4 y 1,7 veces la aparición de lesiones observada cuando se administró la dosis menor (5 mg/kg), y 2,4 y 2,3 veces, respectivamente, la capacidad de la larva para fijarse o penetrar el tracto gastrointestinal; en todos los casos, los factores asociados a estas variables adquieren significación. En cuanto a la eficacia gastroprotectora de la sarsasapogenina, podría estar relacionada, al menos en parte, con su estructura de espirostano, tal como indicaron Matsuda et al. (2003) en su estudio del efecto de varias saponinas sobre mucosa gástrica dañada por indometacina y alcohol. En el control de inflamación GI, ninguna de las saponinas testadas dio lugar a valores de la enzima mieoloperoxidasa (MPO) significativamente distintos a los de los animales que no fueron tratados con ningún compuesto. Por otro lado, el estudio histológico de las lesiones observadas al administrar diosgenina y sarsapogenina, a las dosis eficaces, mostró que consistían, en todos los casos, en túneles en los cuales estaba alojada la larva; dichos túneles iban acompañados de escasa hemorragia. Sin embargo, en los animales control, en todos los casos se observaron úlceras rodeadas de un halo hemorrágico, en general de gran intensidad. En estos animales, mediante PCR-RFLP del ITS1 se identificó la especie larvaria que se adhirió y/o atravesó su estómago, siendo principalmente (72,2%) A. simplex s.s., y el resto de lesiones (5/18) fueron causadas por su especie hermana A. pegreffii. En los animales tratados con diosgenina, en cambio, todas las larvas responsables del daño estomacal se identificaron como A. simplex s.s. (2/2). Otro punto a destacar es el alto índice de parasitación por Anisakis en los peces que habitan en las aguas de la península Ibérica, en particular en la bacaladilla (Micromesistius poutassou). Por ello, se precisa realizar estudios epidemiológicos, a fin de conocer en profundidad en la península Ibérica, la ecología de Anisakis en este hospedador. El golfo de Cádiz (36ᐤ49’60’’N, 71º10’00’’W) es un lugar de gran interés ecológico, debido a la confluencia de las aguas mediterráneas y atlánticas, cálidas y frías respectivamente, situado en la costa sureste de la Península Ibérica. El 82,0% (82/100) de las 100 bacaladillas inspeccionadas mediante digestión pépsica y observación visual, estaban parasitadas. El número de larvas L3 de Anisakis recogidas fue de 1350. Todas ellas fueron identificadas morfológicamente como L3 tipo I. Sólo tres pescados se encontraron con más de 150 parásitos, concretamente 171, 229 y 328 larvas. Los valores de los parámetros epidemiológicos estudiados, intermedios entre los presentados por bacaladillas de aguas atlánticas y mediterráneas (Chía et al. 2010; Madrid et al. 2012; Piras et al. 2014), podrían ser reflejo de la migración de los peces, correspondiente a la intensa corriente que tiene lugar cuando el agua del Atlántico ingresa en el mar Mediterráneo a través del estrecho de Gibraltar (Molina-Fernández, tesis, 2018). Las prevalencias de infección obtenidas han sido elevadas en las tres estaciones del año analizadas, otoño, invierno y primavera, alcanzándose el 100% esta última. Sin embargo, las intensidades y abundancias medias más altas se registraron en invierno. En otoño se observan los valores de parasitación de la musculatura dorsal más bajos. Nuestros resultados muestran una mayor prevalencia de A. pegreffii, de forma que un 70% de los peces están parasitados por esta especie, el 33,0% en infección simple, frente al 38,0% de prevalencia de A. simplex s.s. En lo que se refiere a la musculatura, las prevalencias de infección por A. simplex s.s. y A. pegreffii tienden a igualarse con ligero predominio de la primera. Pero sobre todo, se detecta una marcada diferencia en la intensidad de infección por ambas especies, de forma que el número de larvas de A. simplex s.s. duplica al de A. pegreffii en esta localización. Respecto a los factores de riesgo analizados por regresión logística, la parasitación general por A. simplex s.l., no mostró linealidad significativa con el peso ni la longitud del pez, ni tampoco con la estación del año. En el estudio, cabe destacar las elevadas cifras de intensidad y abundancia medias, principalmente debidas a A. simplex s.s., en bacaladillas de 21-21,9 cm que son ejemplares relativamente pequeños con aproximadamente 3 años de edad, que podrían haber alcanzado la madurez. Cuando diferenciamos entre las especies de A. simplex s.l., se observa que A. pegreffii es casi tres veces más frecuente que A. simplex s.s. en vísceras, mientras que en invierno ocurre lo contrario, y A. simplex s.s. es dos veces más frecuente que A. pegreffii en esta localización. Los factores asociados a la presencia del parásito en musculatura ventral o dorsal son distintos; en invierno, la musculatura ventral de la bacaladilla alberga 9 veces más larvas de A. pegreffii que de A. simplex s.s. Por el contrario, en musculatura dorsal, la mayor presencia de parásitos (A. simplex s.l.) se produce en primavera. Los híbridos han mostrado un comportamiento similar a A. simplex s.s. en todas las localizaciones. La detección de híbridos A. simplex s.s./A. pegreffii ha sido un tema de controversia a pesar de que la hibridación natural es un proceso extendido entre los organismos parásitos y de vida libre. En ambas especies se han hallado diferencias de importancia biomédica, tanto en la expresión génica de sus alérgenos como en su poder patógeno/invasivo (Romero et al. 2013; Arcos et al. 2014; Llorens et al. 2018), lo cual subraya la necesidad de centrarnos en este fenómeno mediante la búsqueda de nuevas dianas moleculares identificativas de estas especies y sus híbridos. Para el estudio se obtuvieron larvas de Anisakis de bacaladillas (M. poutassou), merluzas (M. merluccius), y boquerones (E. encrasicolus). Además de las aguas ibéricas, se seleccionaron zonas alopátricas para A. simplex s.s., los caladeros del Océano Atlántico Norte (LSB) y para A. pegreffii, del mar Adriático de Italia y Croacia. Se identificaron mediante PCR-RFLP del gen ITS del ADNr. Con el objetivo de diseñar una PCR-RFLP del gen Cox-2 del ADNmt, se llevó a cabo la secuenciación y análisis que nos permitió seleccionar las enzimas de restricción del Cox-2: AccI cortaría el ADNmt de A. simplex s.s. pero no cortaría el de A. pegreffii, mientras que AvrII haría lo opuesto; esta técnica identificó 101/104 especímenes. Como nuevo marcador nuclear, se optimizó el gen β-tubulina para implementar la PCR y analizar las secuencias de 41 individuos. Se obtuvo un fragmento de 650 pares de bases (pb) de longitud para la mayoría de las larvas, mientras que tuvo que realizarse una nested-PCR para 11 larvas amplificándose de este modo un fragmento de 450 pb. Se detectaron 21 posiciones polimórficas en el alineamiento de 534 pb de las secuencias, y se identificaron 15 genotipos englobados en A. simplex s.s, A. pegreffii e híbridos As/Ap. El análisis de las secuencias permitió identificar a A. simplex s.s. y A. pegreffii como dos especies distintas mediante 7 diferencias fijas entre ellas. La posición 451 no fue consistentemente diferente entre ambas especies. El genotipo heterocigoto TUB se detectó en las 7 posiciones nucleotídicas de diagnóstico, en 3 larvas de las 15 identificadas como genotipo híbrido mediante PCR-RFLP del gen ITS. En estos 3 individuos, la posición 451 fue también heterocigota. Para el diseño de la PCR-RFLP se eligieron potenciales enzimas de restricción: TscAI cortó el ADNn de de A. simplex s.s., mientras que Hin1II cortó las secuencias de ambas especies, identificando así el 100% (104/104) de los especímenes. Cuando se utilizó el marcador β-TUB, se detectaron menos híbridos que con el marcador ITS1, los cuales solo se hallaron en aguas ibéricas. Aunque se ha puesto en entredicho su valor para distinguir híbridos y su progenie retrocruzada, debido a su alto número de copias, los datos de ITS1 son más sensibles a la detección de híbridos que otros marcadores (Steinauer et al. 2008). Respecto al análisis poblacional de las áreas geográficas muestreadas, sólo la población Atlántico-Mediterránea se encontró en desequilibrio Hardy-Weinberg cuando se analizó el gen β-TUB, confirmando que A. simplex s.s. y A. pegreffii son dos especies diferentes. El análisis de clusters mediante el programa Structure utilizando los loci β-TUB e ITS mostró distinta probabilidad de agrupación: cuando no se incluyó la posición 451 β-TUB en el estudio, se obtuvo con la mayor probabilidad la existencia de dos poblaciones de Anisakis (K= 2), correspondientes a las dos especies parentales. Esta misma situación se determinó cuando sí se analizó la posición 451 β-TUB, y además se pre-definieron cinco poblaciones según la pertenencia de los individuos a las cinco áreas. En el caso de analizar la posición 451 sin pre-designación de poblaciones, nos encontramos con una mayor probabilidad de que los individuos de nuestra muestra se dividan en 3 clusters, correspondientes a los 3 genotipos hallados con los dos marcadores nucleares, A. simplex s.s, A. pegreffii e híbridos As/Ap. El programa Newhybrids nos proporcionó la asignación de los individuos a su clase híbrida correspondiente utilizando la información de los dos genes nucleares, ITS1 y β-TUB; el programa categorizó a los tres híbridos putativos como F1, los cuales habían mostrado carácter heterocigoto con ambos marcadores. Los individuos no designados como parentales se asignaron a una u otra clase parental, con elevada probabilidad (0,99), dejando una mínima posibilidad de asignación a la categoría de retrocruzamiento con el parental, aunque este análisis presenta la limitación de desigual número de posiciones en ambos loci. En los árboles consenso (distancias, ML y MP) con el gen β-TUB, los híbridos detectados se agruparon con los individuos A. simplex s.s. separados de los de A. pegreffii con un soporte de boostrap adecuado, mientras que el análisis genealógico mostró esta misma situación en una sola red de conexión. Cuando se ensamblaron los tres genes β-TUB, ITS y Cox-2, los híbridos detectados con el gen β-TUB se agruparon también en este caso con el genotipo puro A. simplex s.s., mientras que los híbridos con el ITS cayeron acordemente en los tres grupos, los dos parentales puros y los individuos con introgresión mitocondrial situados entre los parentales. Estos mismos grupos poblacionales figuraron en la red Median-Joining, íntimamente conectados entre sí, los cuales integraron a los híbridos de la misma forma que las ramas del árbol. Nuestra técnica de genotipaje mediante PCR-RFLP con marcadores múltiple, ITS-1, Cox-2 y β-TUB, resultó ser un procedimiento simple que permitió detectar las dos especies parentales puras, sus híbridos F1, progenie híbrida retrocruzada y los individuos con introgresión mitocondrial única. Todos los híbridos F1 e híbridos resultantes de retrocruzamiento de híbridos F1 con la especie parental se detectaron en las áreas simpátricas, donde los fenómenos de retrocruzamiento inducirían a la recuperación de las características genéticas de las especies parentales.