Desarrollo de procesos biotecnológicos basados en cepas de pseudomonas putida. Mecanismos de señalización y biosíntesis de antibióticos

Resumen

La aparición de cada vez más bacterias multi-resistentes a antibióticos está dando lugar a infecciones crónicas que pueden presentar serios riesgos para pacientes inmunodeprimidos y/o de avanzada edad. Los principales mecanismos de resistencia a antibióticos por parte de las bacterias se deben a la resistencia adquirida (mutaciones y transferencia horizontal de genes), resistencia adaptativa (respuesta a cambios ambientales) y resistencia intrínseca (bombas de extrusión y membrana lipídica). Esto ha despertado el interés de la comunidad científica por el estudio de los mecanismos de resistencia a antibióticos, así como por la búsqueda de nuevas moléculas bioactivas en la lucha frente a estas bacterias multi-resistentes, ya que actualmente se siguen utilizando los antibióticos descubiertos en la edad de oro de los antibióticos, entre 1940 y 1960. Pseudomonas putida DOT-T1E, una bacteria capaz de crecer en presencia de altas concentraciones de disolventes tóxicos y antibióticos, es una bacteria clave para el estudio de los mecanismos de resistencia a este tipo de compuestos, a pesar de no ser una bacteria patógena para humanos. Sus principales mecanismos de resistencia a este tipo de compuestos son las bombas de tipo RND que expulsan los compuestos tóxicos al exterior celular. Las principales bombas de extrusión de DOT-T1E son las llamadas TtgABC, TtgDEF y TtgGHI. TtgABC, regulada por TtgR, es la principal bomba relacionada con la extrusión de antibióticos, mientras que TtgDEF y TtgGHI están reguladas por TtgV y son las encargadas de la expulsión de disolventes desde el interior de la célula hacia el medio. Ambos reguladores actúan constitutivamente reprimiendo la expresión de las bombas, las cuales se activan cuando el represor reconoce alguna molécula, sufre un cambio conformacional y de esta forma libera el promotor de la bomba de extrusión, lo que permitirá mayores niveles de expresión de la misma y un aumento de la resistencia de la bacteria. El trabajo experimental del primer y segundo capítulo de esta Tesis Doctoral persigue identificar residuos clave en la transmisión de la señal intramolecular en el regulador transcripcional TtgV, y estudiar el papel del indol en la resistencia a antibióticos de P. putida DOT-T1E, así como su efecto como molécula de señalización inter-especie. TtgV es un regulador que se había cristalizado y caracterizado previamente en nuestro grupo (Lu et al., 2010, Genes Dev). Mediante técnicas de mutagénesis y de calorimetría de titulación isotérmica (ITC), en este trabajo hemos estudiado el papel clave del residuo Q86 demostrando que este residuo es de vital importancia para la transmisión de la señal entre el dominio de reconocimiento de ligando y el dominio de unión a ADN. El estudio de otros aminoácidos claves relacionados con la unión a ADN, como son los residuos en las posiciones 19, 35, 44 y 46, han demostrado que estas posiciones son relevantes para el reconocimiento del ADN por parte de TtgV. El segundo capítulo se ha centrado en el estudio de la resistencia a antibióticos bactericidas y bacteriostáticos por Pseudomonas putida DOT-T1E y el papel en la misma por parte de TtgGHI, bomba de extrusión regulada por la acción de TtgV, un regulador transcripcional que reconoce el indol como efector. Estudios de transcriptómica han puesto de manifiesto que el indol incrementa la expresión de TtgGHI lo que provoca un aumento de la resistencia a antibióticos de P. putida DOT-T1E cuando la principal bomba relacionada con la extrusión de antibióticos, TtgABC, está truncada. Este resultado demuestra un papel secundario de TtgGHI en la extrusión de compuestos antimicrobianos. Diversas enterobacterias son capaces de producir y excretar indol al medio. Co-cultivos de E. coli y variantes génicas de P. putida así como estudios de transcriptómica han permitido demostrar un papel de TtgGHI en la comunicación inter-bacteriana, debido a que el indol producido por otras bacterias puede ser detectado y utilizado para responder a diversos estreses en P. putida DOT-T1E. En el tercer capítulo se ha abordado el objetivo de revelar los mecanismos de resistencia a diversos antibióticos de P. putida DOT-T1E mediante técnicas de secuenciación masiva de ARN. Estos análisis han confirmado los mecanismos de acción descritos para estos antibióticos mediante la expresión de genes relacionados con cada una de las funciones que inhiben, y además, han mostrado nuevos genes que podrían estar actuando en respuesta frente a estos estreses. Análisis a nivel funcional han determinado que, si bien la mayor parte de antibióticos inducen la expresión de funciones como actividad catalítica, unión a ligandos y procesos metabólicos entre otros, los genes que se están induciendo en respuesta a cada antibiótico suelen ser distintos. En esta línea, se han descrito 138 nuevos ARN no codificantes, lo que aumenta los 16 previamente identificados hasta ahora, presentando perfiles de expresión muy similares a los descritos para los ARN mensajero en presencia de antibióticos. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la necesidad de profundizar en el estudio de los mecanismos de acción de los antibióticos con el objetivo de poder combatir de forma más eficiente la resistencia que muestran las bacterias multi-resistentes. En los capítulos cuatro y cinco se ha decidido tratar la aplicación biotecnológica de una cepa de P. putida DOT-T1E mutada en la principal bomba de extrusión de antibióticos como bacteria control en el descubrimiento de nuevos compuestos con actividad antimicrobiana. Del mismo modo, estos capítulos se centran en el aislamiento de una nueva cepa de Pseudomonas capaz de producir una familia de moléculas desconocidas hasta el momento, así como el estudio del efecto de estos compuestos como antimicrobianos y antifúngicos. La búsqueda de nuevos compuestos naturales bioactivos es una prioridad en la lucha frente a bacterias patógenas. El desarrollo de una nueva plataforma de búsqueda de bacterias productoras de compuestos antimicrobianos, usando como bacteria control una cepa de P. putida DOT-T1E más sensible a antibióticos, nos ha permitido aislar diversas bacterias productoras de compuestos conocidos y desconocidos con actividad antimicrobiana. Se ha seleccionado una de ellas, Pseudomonas sp. 250J, que produce xantolisinas, un nuevo tipo de lipodepsipéptidos cíclicos, con actividad antimicrobiana y antifúngica, además de mostrar actividad sinérgica cuando se aplica junto con otros antibióticos. La secuenciación del genoma de 250J nos ha permitido identificar los genes de síntesis de estos compuestos así como otros genes relacionados con la síntesis de metabolitos secundarios. Además, hemos podido identificar una serie de genes relacionados con la potencial patogenicidad de esta bacteria. Con esta Tesis Doctoral se han pretendido analizar y aclarar diversos mecanismos relacionados con la resistencia a antibióticos de la bacteria Pseudomonas putida DOT-T1E, así como desarrollar una nueva plataforma la cual permita una búsqueda eficiente de nuevos compuestos antimicrobianos que ayuden en la lucha frente a las, cada vez más frecuentes, bacterias multi-resistentes.