Papel del segundo mensajero c-di-gmp en pseudomonas syringae pv. Tomato dc 3000

Resumen

Las bacterias fitopatógenas ejercen un control estricto de las funciones implicadas en la interacción con la planta, lo que les permite pasar de un modo de vida libre a otro más ventajoso en estrecha relación con su planta huésped (Camilli y Bassler, 2006;Jenal y Malone, 2006; Mills et al., 2011). El c-di-GMP (diguanilato cíclico) es un segundo mensajero implicado en la regulación de numerosas funciones bacterianas, entre las que destacan muchasimplicadas en la interacción con eucariotas como la virulencia, motilidad, agregación, adhesión y formación debiopelículas (Jenal y Malone, 2006; Schirmer yJenal, 2009; Tamayo et al., 2007; Römlinget al., 2013). En concordancia, Pseudomonas syringae pv. tomatoDC3000, al igual que otras bacterias que interaccionan con plantas tanto patogénicas como simbióticas, presenta en su genoma una gran cantidad de genes que codifican proteínas potencialmente implicadas en la síntesis y degradación de este segundo mensajero. El alto número de proteínas relacionadas con c-di-GMP, sugiere la existencia de una estricta regulación y una alta complejidad en la transducción de señales a través de este segundo mensajero de forma análoga a lo descrito en otros modelos bacterianos más estudiados, como Caulobacter crescentus, que también cambian su estilo de vida dependiendo de las condiciones ambientales (Aldridge et al., 2003; Chan et al., 2004). Sin embargo, esta aparente redundancia génica complica su estudio mediante aproximaciones clásicasde mutación de las diferentes diguanilato ciclasas (DGCs) y fosfodiesterasas (PDEs), por lo que en este trabajo se realizó un doble abordaje: en primer lugar, se llevó a cabo un estudio in silico de las proteínas que hipotéticamente interaccionan con el c-di-GMP en Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 y, en segundo lugar, se identificaron y caracterizaron algunas de ellas y se estudió si estaban implicadas en la interacción de esta bacteria con la planta. El trabajo in silico consistió en hacer un estudio de las proteínas que interaccionan con el c-di-GMP en Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 comparándolas con las presentes en otras bacterias que interaccionan con plantas, tanto fitopatógenas (distintos patovares de Pseudomonas syringae) como simbióticas (diferentes géneros derizobios), e incluso con otras bacterias del género Pseudomonas. Con objeto de hacer el estudio abordable, se llevó a cabo un análisis más detallado de dichas proteínas en las cepas modelo Pseudomonas syringae pv. tomatoDC3000 (Pto) y Sinorhizobium meliloti 1021 (Sme), pero, en la medida de lo posible, el estudio comparativo se ha extendido a otros géneros y especies dentro de la familia Pseudomonadaceae y Rhizobiaceae con diferentes estilos de vida. De este modo, hemos logrado identificar dominios específicos de cepas patógenas y simbióticas, así como proteínas que podrían ser esenciales para la un determinado estilo de vida o tipo de interacción con el hospedador. La segunda aproximación al estudio del papel que desempeña el c-di-GMP en Pto, se realizó provocando un incremento generalizado de los niveles intracelulares de este segundo mensajero mediante la sobreexpresión de una DGC heteróloga de C. crescentus (PleD*, Pérez-Mendoza et al., 2014). Dicho incremento fue corroborado por ensayos de cromatografía acoplados a espectroscopia de masas (HPLC-MS). Teniendo en cuenta la variedad de procesos celulares regulados por c-di-GMP, nos centramos en diversos fenotipos importantes en la interacción con el hospedador, como la morfología de colonia, la motilidad bacteriana, la producción de exopolisacáridos,la formación de biopelículas y la secreción proteica. Al igual que se ha observado en otras bacterias, un incremento de los niveles de c-di-GMP en Pto produjo una disminución acusada de la motilidad, un cambio en la morfología de colonia en placas con Congo Red (colonias rojas y rugosas) y calcoflúor (mayor fluorescencia bajo luz ultravioleta) como consecuencia de un aumento en la producción de exopolisacáridos, una mayor formación de biopelículas en la interfase líquido-aire y una inducción en la secreción de ciertas proteínas periplásmicas. Sin embargo, aunque el incremento generalizado de los niveles intracelulares de c-di-GMP provocó una disminución de la expresión de ciertos determinantes de virulencia de Pto, como el sistema de secreción tipo III, no tuvo un impacto significativo sobre su patogenicidad en tomate, al menos bajo las condiciones ensayadas. El fenotipo de colonia CR+/CF+generado por el incremento en los niveles de c-di-GMP en Pto, nos permitió diseñar una estrategia de mutagénesis para encontrar genes implicados en la señalización de este segundo mensajero.Curiosamente, con esta aproximación se obtuvieron, tanto genes implicados en la pérdida del fenotipo (CR-/CF-) como en la exacerbación del mismo (CR++/CF++). Dentro de los genes identificados se encontraron varios que codificaban hipotéticos transportadores, reguladores transcripcionales (AmrZ), citocromos, una proteína con dominios GGDEF/EAL (MorA) y hasta tres proteínas diferentes implicadas en la síntesis de celulosa, que se caracterizaron fenotípicamente, tanto en vida libre como en asociación con su planta hospedadora. La identificación de hasta nueve inserciones diferentes en el operón de la celulosa wssABCDEFGHI, dando todas ellas lugar a colonias blancas y lisas (CR-/CF-), puso de manifiesto la importancia de la regulación de la producción de la celulosa por c-di-GMP en esta bacteria. Además, la identificación de una inserción en un putativo regulador transcripcional (CR++/CF++) que se ha descrito como represor de diferentes EPS en otras bacterias (AmrZ), ha permitido descubrir un modo novedoso de regulación transcripcional en el operón de síntesis de celulosa de Pto, donde también intervienen otros reguladores transcripcionales como FleQ. Los resultados obtenidos en este trabajo ponen de manifiesto la importancia que juega el c-di-GMP en bacterias que interaccionan con plantas, como Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. En Pto, este segundo mensajero regula procesos como la producción de EPS, motilidad y formación de biopelículas que son clave en las fases iniciales de interacción con la planta hospedadora. Igualmente, este trabajo ha puesto de manifiesto otros posibles efectores cuya relación con el c-di-GMP es aún desconocida, abriendo un futuro interesante para el estudio de este segundo mensajero en esta bacteria modelo.