Regulación de la virulencia en pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Señalización por Gac-Rsm

Resum

Las enfermedades producidas por fitopatógenos constituyen una amenaza para la seguridad alimentaria global, ya que producen pérdidas masivas en las cosechas. La bacteria objeto de este estudio es Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto DC3000), que destaca por causar brotes esporádicos del moteado, enfermedad que provoca en sus hospedadores naturales (tomate y crucíferas), y por ser utilizada como modelo para el estudio de la interacción patógeno-planta junto a Arabidopsis thaliana. En el medio ambiente y en el contexto de la infección, los microorganismos necesitan detectar estímulos ambientales, integrarlos y coordinar una respuesta fisiológica adecuada. Esto se logra mediante sistemas de transducción de señales, como la ruta de señalización Gac-rsm presente en γ-proteobacterias donde controla cambios en el estilo de vida o en el estado metabólico celular. La señalización comienza con la detección de un estímulo desconocido a nivel de la membrana plasmática por el sistema de dos componentes GacS/GacA, que activa la transcripción de ARN reguladores rsm que tienen la función de secuestrar a la familia de proteínas de unión a ARNm CsrA/RsmA. Esta tesis doctoral se centra en el estudio de la ruta Gac-rsm en Pto DC3000, determinando el papel de sus componentes en la interacción con la planta hospedadora y en la virulencia. Se comenzó estudiando la diversidad y distribución de las proteínas CsrA dentro del género Pseudomonas, lo que reveló que CsrA2/RsmA está presente en todas las cepas, que la presencia de las variantes CsrA1, CsrA2 y CsrA3 está conservada dentro del linaje P. fluorescens (donde se encuentra P. syringae), que la variante RsmF es exclusiva de P. aeruginosa, y que existen otras muchas variantes todavía no estudiadas ni clasificadas. La variabilidad observada no había sido descrita anteriormente en ningún otro grupo bacteriano, lo que puede ser explicado por el hecho de que los miembros de este género son excepcionalmente diversos metabólicamente, ocupan nichos muy diferentes y presentan una gran plasticidad genómica. De los cinco genes codificantes para proteínas CsrA presentes en el genoma de Pto DC3000 (cuatro de ellos previamente anotados y uno identificado en este trabajo) se detectaron los transcritos de csrA2, csrA3 y csrA5 en las condiciones de estudio. En cuanto a la funcionalidad, CsrA3 es el regulador central en esta cepa, favoreciendo por un lado la multiplicación celular y la acumulación de ácido salicílico en cultivos con deficiencia de hierro y, por otro, reprimiendo la síntesis del biosurfactante siringafactina esencial para motilidad tipo swarming, la producción del exopolisacárido alginato, la producción del sideróforo pioverdina en medios con deficiencia de hierro y el ensamblaje del sistema de secreción de tipo 3 necesario para la virulencia. Todos los procesos regulados por CsrA3 están también controlados por CsrA2, con un efecto más moderado, mientras que CsrA1 no parece ejercer ninguna función. La funcionalidad de CsrA4 y CsrA5 solo se comprobó mediante sobreexpresión. Pto DC3000 codifica siete ARN rsm, cuyos promotores mostraron una actividad variable entre ellos que fue mayor en medios ricos nutricionalmente y que aumentó con la densidad celular. La expresión de los promotores fue alta para rsmX3, rsmX5 y rsmY, baja para rsmX1 y rsmZ y variable para rsmX2 y rsmX4. De forma general, se pudieron asociar a los niveles de expresión con las regiones -35 y -10 de sus promotores, mientras que la dependencia de GacA observada se pudo explicar por la cantidad y posición de los residuos conservados con respecto a la secuencia consenso para la unión de este regulador. Además, se comprobó la funcionalidad de rsmY y rsmZ, ya que su sobreexpresión desde un plásmido revirtió parcialmente el fenotipo de un mutante gacA. En resumen, este trabajo supone un avance en el conocimiento de la fisiología P. syringae pv. tomato DC3000 y, en concreto, del funcionamiento de su compleja ruta Gac-rsm y su papel en la interacción de esta bacteria con la planta. Se ha revelado la regulación de múltiples procesos celulares y genes a través de esta ruta y se ha profundizado en el estudio de la expresión y función específica de las cinco proteínas CsrA y los siete ARN reguladores rsm.