Biofilms de pseudomonas putidaconexión entre metabolismo y regulación mediada por diguanilato cíclico, y papel en la tolerancia a estrés derivado de compuestos tóxicos

Résumé

En el medio ambiente, las bacterias pueden encontrarse viviendo de forma libre o constituyendo poblaciones sésiles, siendo esta última el modo de vida preferente de estos organismos. De hecho, algunas estimaciones sugieren que más del 90% de las bacterias se encuentran viviendo en forma de biopelículas o biofilms (Geesey et al., 1977; Costerton et al., 1995). Las biopelículas son comunidades multicelulares y multidimensionales, constituidas normalmente por más de una especie bacteriana, en la que los organismos viven embebidos en una matriz producida casi en tu totalidad por ellos mismos, conocida como matriz extracelular. Estas biopelículas pueden contener una elevada densidad celular, que se ha estimado entre 108 y 1011 células por gramo de peso seco o por mililitro (Griebler et al., 2001; Morgan-Sagastume et al., 2008; Balzer et al., 2010). Normalmente, las biopelículas se encuentran asociadas a superficies, tanto de tipo biótico como abiótico, donde la primera capa de células está en contacto directo con el sustrato. Sin embargo, también pueden encontrarse en forma de flóculos, que son biopelículas móviles formadas por la agregación celular sin estar unidas a ningún tipo de sustrato (Flemming et al., 2016). La matriz extracelular es esencial para la formación de las biopelículas puesto que actúa como una plataforma de anclaje de la estructura tridimensional de las mismas y puede llegar a constituir hasta el 90% de la biomasa que las constituye (Flemming and Wingender, 2010). Esta matriz extracelular está compuesta por proteínas, exopolisacáridos, lípidos y ADN extracelular, en diferentes proporciones según la composición bacteriana de las biopelículas (Martínez-Gil et al., 2010; Mann and Wozniak, 2012; Castillo-Pedraza et al., 2017). Sin embargo, es el agua el principal componente, el cual puede llegar a constituir más del 97% de la matriz extracelular (Flemming et al., 2016). Las biopelículas son claves para la colonización, adaptación y supervivencia de las bacterias a muy diferentes y cambiantes hábitats debido a distintos factores. En primer lugar, dentro de la biopelícula se establecen interacciones sociales tales como cooperatividad metabólica, donde se produce un intercambio, eliminación y redistribución de los nutrientes, facilitado por canales acuosos formados dentro de las biopelículas (Davey and O´Toole, 2000; Flemming et al., 2016). En segundo lugar, es un ambiente muy favorable para adquirir nuevas características genéticas como resultado del intercambio genético entre las bacterias, lo cual puede llegar a conferir ventajas adaptativas (Ghigo, 2001; Stalder and Top, 2016). En último lugar, la matriz extracelular proporciona protección frente a una gran cantidad de condiciones adversas tales como la toxicidad provocada por metales (Teitzel and Parsek, 2003; Grumbein et al., 2014), la exposición a ácidos (McNeill and Hamilton, 2003), la deshidratación y salinidad (Nielsen et al., 2011), así como protección ante sustancias antimicrobianas (Høiby et al., 2010; Gupta et al., 2018) y a las defensas del hospedador (Kai-Larsen et al., 2010; Tian et al., 2018). Para facilitar el estudio de la formación de biopelículas en el laboratorio normalmente se ha recurrido al empleo de modelos monoespecíficos, lo cual ha facilitado profundizar en el conocimiento de los determinantes moleculares, así como en la caracterización de rutas y componentes reguladores implicados en la formación de las mismas. De hecho, el desarrollo de estas biopelículas está alta y finamente regulado. Un primer nivel de regulación es debido a señales ambientales, tales como propiedades de la superficie donde se va a establecer la biopelícula y factores externos como el pH, la temperatura o la disponibilidad de nutrientes, como el calcio o el hierro (Chavant et al., 2002; Palmer et al., 2007). No se conoce completamente cómo son detectadas estas señales, pero en muchas bacterias se encuentran implicados sistemas de dos componentes, los cuales detectan el estímulo ambiental y transducen la señal al interior celular. Un segundo nivel de regulación es debido a la comunicación intracelular mediante lo que se conoce como quorum sensing, el cual está basado en moléculas pequeñas difusibles que una vez alcanzan una determinada concentración, activan mecanismos que coordinan la expresión de genes específicos de forma dependiente de la densidad celular (Whiteley et al., 1999; Rampioni et al. 2016), lo que permite sincronizar determinados comportamientos e influye en el desarrollo de la biopelícula. Por último, un tercer nivel de regulación es debido a moléculas intracelulares conocidas como segundos mensajeros, que permiten amplificar intracelularmente una señal externa detectada por la bacteria, lo que lleva a que se desencadene una transducción de la señal que conduce a una respuesta biológica, donde multitud de genes pueden ser regulados a distintos niveles. Uno de los segundos mensajeros clave para la formación y regulación de una biopelícula es el diguanilato cíclico o c-di-GMP (Römling et al., 2013). Todos estos niveles de comunicación llevan a rutas reguladoras que a menudo están interconectadas, existiendo reguladores transcripcionales y post-transcripcionales que actúan a modo de controles adicionales. Esta Tesis Doctoral se ha centrado en varios aspectos de la formación de biopelículas por Pseudomonas putida, una especie ubicua en el medio ambiente y que presenta gran versatilidad metabólica, siendo microorganismo modelo en estudios de degradación de contaminantes. En nuestro laboratorio, la cepa más ampliamente estudiada es KT2440, la cual es una eficiente colonizadora de la espermosfera y del sistema radicular de plantas con intereses tanto básicos como agronómicos, estableciendo una interacción beneficiosa con las plantas (Espinosa-Urgel et al., 2000; Matilla et al., 2010). Trabajos previos del grupo habían permitido identificar genes que se encuentran preferencialmente expresados en poblaciones de P. putida KT2440 en la rizosfera de maíz (Matilla et al., 2007). Uno de estos genes codifica un regulador de respuesta con actividad diguanilato ciclasa, actualmente denominado CfcR. Esta proteína parece ser la que principalmente contribuye a aumentar los niveles de c-di-GMP en P. putida KT2440 (Huertas-Rosales et al., 2017). La sobreexpresión de CfcR causa un aumento del segundo mensajero que está asociado a cambios fenotípicos en la bacteria, incluyendo un incremento en la formación de biofilms y una morfología de colonia alterada, que denominamos “de encaje”. Mediante una mutagénesis al azar en condiciones de sobreexpresión de CfcR, se han obtenido mutantes afectados en la vía de señalización por c-di-GMP o/y en genes implicados en fenotipos asociados con la sobreexpresión de CfcR. Dos de los mutantes obtenidos, cfcK-66 y cfcK-74, se encuentran afectados en los genes argG y argH respectivamente, los cuales codifican para enzimas que catalizan los dos últimos pasos de la ruta biosintética de arginina (Ramos-González et al., 2016), siendo éste el punto de partida de esta Tesis Doctoral. En el capítulo 1, “Connecting amino acid metabolism with c-di-GMP levels and associated phenotypes in Pseudomonas putida KT2440” se han construido los mutantes nulos correspondientes a cfcK-66 y cfcK-74, profundizándose en su caracterización en cuanto a niveles de c-di-GMP, formación de biopelículas y morfología de colonias. A diferencia de la cepa silvestre, estos mutantes presentaron bajos niveles de c-di-GMP y habían perdido el fenotipo de encaje, al igual que ocurría con los respectivos mutantes por transposición, aunque CfcR estuviera presente en multicopia. Sin embargo dichos fenotipos eran recuperados en presencia del aminoácido arginina. Así pues, en este capítulo se ha analizado en detalle la implicación de este aminoácido sobre dichos fenotipos, encontrándose que es capaz de causar un incremento en los niveles de c-di-GMP tanto en la cepa silvestre como en los mutantes, del mismo modo que se ha perfilado estar implicado en el fenotipo de encaje, y además provoca un aumento en la formación de biopelículas, tanto adicionando el aminoácido de forma exógena como sobreexpresando los genes argG y argH. Por otro lado, el aminoácido ácido aspártico, uno de los precursores para la síntesis de arginina, desencadena los efectos opuestos, es decir, provoca una disminución en los niveles de c-di-GMP, reduce la capacidad de formación de biopelículas y reduce la capacidad de formar encaje en la cepa silvestre. Para determinar si el efecto del aminoácido arginina sobre los niveles de c-di-GMP era específico, se ensayaron el resto de aminoácidos proteinogénicos, encontrándose que la respuesta era bastante específica, puesto que aunque otros aminoácidos provocaron también un aumento en los niveles del segundo mensajero, no fueron tan importantes como en el caso de la arginina. Dado que los mutantes por transposición fueron originalmente seleccionados en presencia de múltiples copias de CfcR, se determinó si la alteración fenotípica y en cuanto a los niveles de c-di-GMP en los mutantes argG y argH era debida a una alteración en la expresión de cfcR. Las diferencias obtenidas con respecto a la cepa silvestre fueron escasas, además un mutante en cfcR y en el “multisensor” híbrido con actividad histidina quinasa, encargada de fosforilar a esta diguanilato ciclasa para que sea activa, mantuvieron la respuesta a arginina en cuanto al incremento de los niveles de c-di-GMP, lo cual indicó que otros elementos son necesarios para explicar la respuesta al aminoácido. Este hecho nos ha permitido seguir profundizando sobre ello en el siguiente capítulo. En el capítulo 2, “Identification of the regulatory network associating arginine metabolism and c-di-GMP signalling” se ha estudiado en más detalle la conexión del metabolismo de la arginina y la señalización mediada por c-di-GMP, a nivel de regulación. Para ello se ha estudiado el papel de diferentes reguladores descritos previamente en el grupo que modulan la formacion de biopelículas de P. putida KT2440, bien porque tienen un papel sobre los elementos estructurales de la biopelícula como adhesinas y exopolisacáridos, o sobre la regulación de la diguanilato ciclasa CfcR. Así pues, se ha estudiado el efecto de los reguladores transcripcionales RpoS y FleQ y de las proteínas reguladoras post-transcripcionales pertenecientes a la familia Rsm (RsmA, RsmE y RsmI) sobre los genes argG y argH, así como el papel de estos genes o de su producto, la arginina, sobre la expresión de alguno de ellos. También se ha explorado el papel que tiene el regulador transcripcional ArgR sobre la regulación de argG y argH, por ser el regulador central del metabolismo de la arginina. De esta forma, se ha determinado la existencia de una cascada regulatoria que involucra a las proteínas Rsm, RpoS, FleQ y ArgR que conlleva a la regulación de argG y argH y se han establecido mecanismos de retroalimentación sobre alguno de los elementos reguladores. Además, se ha demostrado la influencia de altos niveles de c-di-GMP en la expresión de argR a través de FleQ. Por otra parte, se ha caracterizado en P. putida KT2440 el operón argT-hisQMP-argR, donde se encuentra localizada la principal proteína de unión a arginina implicada en su trasporte (ArgT), así como ArgR, estudiándose la influencia de ArgR sobre su propia expresión y sobre argT. Los resultados de este capítulo nos han permitido proponer un modelo de regulación mediante el cual se pone de manifiesto la existencia de la conexión del metabolismo de la arginina y el segundo mensajero c-di-GMP. En el capítulo 3, “Exploring the connection between arginine metabolism and production of the siderophore pyoverdine” se hace una primera aproximación a la conexión entre el metabolismo de la arginina y la producción del sideróforo pioverdina, implicado en la captura de hierro Este estudio se inició debido a que en el transcurso de la caracterización de los mutantes argG y argH en el Capítulo 1, se observó menor producción de pioverdina en estos mutantes. Así, se ha demostrado que mutantes auxótrofos en la ruta de biosíntesis de arginina están afectados en la producción del sideróforo y que la arginina restaura esa capacidad. Sin embargo, este aminoácido no forma parte estructural de las pioverdinas de P. putida KT2440 (Wei y Aristilde, 2015). Además, se ha demostrado que los mutantes argG y argH realmente producen pioverdina, pero queda retenida en el interior celular, probablemente debido a que la expresión del transportador pvdE, encargado de transportar el precursor inmaduro de la pioverdina desde el citoplasma al espacio periplásmico, está reducida en estos mutantes. La deficiencia en la liberación de pioverdina al medio extracelular provoca que los mutantes argG y argH sean más sensibles a la escasez de hierro y a estrés oxidativo. En el capítulo 4, “Influence of stress caused by toxic hydrocarbons on development and resilience of Pseudomonas putida biofilms: a preliminary analysis” se pretende iniciar una línea de trabajo sobre el papel de los biofilms en la resistencia a estrés, explorando cómo se afecta la formación de biopelículas en distintas cepas de P. putida en presencia de un hidrocarburo aromático como es el tolueno, ya que está poco estudiado cómo el metabolismo de estos compuestos puede influenciar el estilo de vida de esta bacteria. Para ello, se han utilizado tres cepas de P. putida, mt-2, KT2440 y DOT-T1E, con distintas capacidades de tolerancia y metabolismo de compuestos aromáticos. Se ha comparado la formación de biopelículas en presencia tolueno, tanto en cultivos pre-expuestos al tóxico, como no pre-expuestos, además de estudiar cómo la presencia del tóxico afecta a biopelículas ya preformadas. Los resultados obtenidos en este capítulo determinaron que en cultivos inicialmente no pre-expuestos al tóxico, la presencia de bajas concentraciones del mismo favoreció la formación de biopelículas en todas las cepas estudiadas, aunque altas concentraciones provocaron el efecto opuesto. Además, en cultivos pre-expuestos al tóxico, las biopelículas persistieron más tiempo que en ausencia del estresor, indicando que la presencia del tóxico puede favorecer la vida sésil de las bacterias, como un mecanismo de defensa frente a estrés. Sin embargo, la adición de tolueno a biopelículas preformadas en ausencia de tolueno, provocó un rápido desprendimiento de las biopelículas, probablemente a causa de que sus matrices extracelulares no están “preparadas”. Esta Tesis Doctoral, aporta por una parte nueva información clave de cómo señales metabólicas pueden influir en el proceso de formación de las biopelículas en P. putida KT2440, permitiendo proponer un modelo más completo sobre la regulación de este proceso, en el cual se ha incluido la existencia de una conexión entre el metabolismo de la arginina y el c-di-GMP en esta bacteria. Por otro lado, revela una conexión entre este aminoácido, la captación de hierro y el estrés oxidativo, clave para la vida multicelular de P. putida y la colonización de la rizosfera. Por otro lado, ha permitido iniciar una nueva línea de investigación sobre cómo compuestos tóxicos metabolizables influyen en las biopelículas de P. putida, un campo de gran interés a nivel biotecnológico. -Balzer, M., Witt, N., Flemming, H.-C., and Wingender, J. (2010). Faecal indicator bacteria in river biofilms. Water Science and Technology, 61(5), 1105–1111. -Castillo Pedraza, M. C., Novais, T. F., Faustoferri, R. C., Quivey, R. G., Terekhov, A., Hamaker, B. R., and Klein, M. I. (2017). Extracellular DNA and lipoteichoic acids interact with exopolysaccharides in the extracellular matrix of Streptococcus mutans biofilms. Biofouling, 33(9), 722–740. -Chavant, P., Martinie, B., Meylheuc, T., Bellon-Fontaine, M.-N., and Hebraud, M. (2002). Listeria monocytogenes LO28: surface physicochemical properties and ability to form biofilms at different temperatures and growth phases. Applied and Environmental Microbiology, 68(2), 728–737. -Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., and Lappin-Scott, H. M. (1995). Microbial biofilms. Annual Reviews in Microbiology, 49(1), 711–745. -Davey, M. E., and O’toole, G. A. (2000). Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64(4), 847–867. -Espinosa-Urgel M., Salido A., Ramos J.L. (2000) Genetic analysis of functions involved in adhesion of Pseudomonas putida to seeds. Journal of Bacteriology, 182(9), 2363-2369. Flemming, H.-C., and Wingender, J. (2010). The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology, 8(9), 623–633. -Flemming, H.-C., Wingender, J., Szewzyk, U., Steinberg, P., Rice, S. A., and Kjelleberg, S. (2016). Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology, 14(9), 563. -Geesey, G. G., Richardson, W. T., Yeomans, H. G., Irvin, R. T., and Costerton, J. W. (1977). Microscopic examination of natural sessile bacterial populations from an alpine stream. Canadian Journal of Microbiology, 23(12), 1733–1736. -Ghigo, J.-M. (2001). Natural conjugative plasmids induce bacterial biofilm development. Nature, 412, 442. -Griebler, C., Mindl, B., and Slezak, D. (2001). Combining DAPI and SYBR Green II for the enumeration of total bacterial numbers in aquatic sediments. International Review of Hydrobiology, 86(4–5), 453–465. -Grumbein, S., Opitz, M., and Lieleg, O. (2014). Selected metal ions protect Bacillus subtilis biofilms from erosion. Metallomics, 6(8), 1441–1450. -Gupta, P., Mankere, B., Chekkoora Keloth, S., Tuteja, U., Pandey, P., and Chelvam, K. T. (2018). Increased antibiotic resistance exhibited by the biofilm of Vibrio cholerae O139. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, dky127. -Høiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., and Ciofu, O. (2010). Antibiotic resistance of bacterial biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents, 35(4), 322–332. -Huertas‐Rosales, Ó., Romero, M., Heeb, S., Espinosa‐Urgel, M., Cámara, M., and Ramos‐González, M. I. (2017). The Pseudomonas putida CsrA/RsmA homologues negatively affect c‐di‐GMP pools and biofilm formation through the GGDEF/EAL response regulator CfcR. Environmental Microbiology, 19(9), 3551–3566. -Kai-Larsen, Y., Lüthje, P., Chromek, M., Peters, V., Wang, X., Holm, Å., Kádas, L., Hedlund, K.-O., Johansson, J., and Chapman, M. R. (2010). Uropathogenic Escherichia coli modulates immune responses and its curli fimbriae interact with the antimicrobial peptide LL-37. PLoS Pathogens, 6(7), e1001010. -Mann, E. E., and Wozniak, D. J. (2012). Pseudomonas biofilm matrix composition and niche biology. FEMS Microbiology Reviews, 36(4), 893–916. -Martínez‐Gil, M., Yousef‐Coronado, F., and Espinosa‐Urgel, M. (2010). LapF, the second largest Pseudomonas putida protein, contributes to plant root colonization and determines biofilm architecture. Molecular Microbiology, 77(3), 549–561. -Matilla, M. A., Espinosa-Urgel, M., Rodríguez-Herva, J. J., Ramos, J. L., and Ramos-González, M. I. (2007). Genomic analysis reveals the major driving forces of bacterial life in the rhizosphere. Genome Biology, 8(9), R179. -Matilla M.A., Ramos J.L., Bakker P.A., Doornbos R., Badri D.V., Vivanco J.M., Ramos-González M.I. (2010) Pseudomonas putida KT2440 causes induced systemic resistance and changes in Arabidopsis root exudation. Environmental Microbiology Reports. 2(3), 381-8. -McNeill, K., and Hamilton, I. R. (2003). Acid tolerance response of biofilm cells of Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters, 221(1), 25–30. -Morgan-Sagastume, F., Larsen, P., Nielsen, J. L., and Nielsen, P. H. (2008). Characterization of the loosely attached fraction of activated sludge bacteria. Water Research, 42(4–5), 843–854. -Nielsen, L., Li, X., and Halverson, L. J. (2011). Cell–cell and cell–surface interactions mediated by cellulose and a novel exopolysaccharide contribute to Pseudomonas putida biofilm formation and fitness under water‐limiting conditions. Environmental Microbiology, 13(5), 1342–1356. -Palmer, J., Flint, S., and Brooks, J. (2007). Bacterial cell attachment, the beginning of a biofilm. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 34(9), 577–588. -Ramos-González, M. I., Travieso, M. L., Soriano, M. I., Matilla, M. A., Huertas-Rosales, Ó., Barrientos-Moreno, L., Tagua, V. G., and Espinosa-Urgel, M. (2016). Genetic dissection of the regulatory network associated with high c-di-GMP levels in Pseudomonas putida KT2440. Frontiers in Microbiology, 7, 1093. -Rampioni, G., Falcone, M., Heeb, S., Frangipani, E., Fletcher, M. P., Dubern, J.-F., Visca, P., Leoni, L., Cámara, -M., and Williams, P. (2016). Unravelling the genome-wide contributions of specific 2-alkyl-4-quinolones and PqsE to quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Pathogens, 12(11), e1006029. -Römling, U., Galperin, M. Y., and Gomelsky, M. (2013). Cyclic di-GMP: the first 25 years of a universal bacterial second messenger. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 77(1), 1–52. -Stalder, T., and Top, E. (2016). Plasmid transfer in biofilms: a perspective on limitations and opportunities. Npj Biofilms And Microbiomes, 2, 16022. -Teitzel, G. M., and Parsek, M. R. (2003). Heavy metal resistance of biofilm and planktonic Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology, 69(4), 2313–2320. -Tian, X.-L., Salim, H., Dong, G., Parcells, M., and Li, Y.-H. (2018). The BceABRS four-component system that is essential for cell envelope stress response is involved in sensing and response to host defence peptides and is required for the biofilm formation and fitness of Streptococcus mutans. Journal of Medical Microbiology, 67, 874–883. -Whiteley, M., Lee, K. M., and Greenberg, E. P. (1999). Identification of genes controlled by quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences, 96(24), 13904–13909.