Papel de los jasmonatos y prosistemina en el establecimiento y desarrollo de una simbiosis micorrízica arbuscular

Resumen

Papel de los jasmonatos y prosistemina en el establecimiento y desarrollo de una simbiosis micorrízica arbuscular. Las plantas en su medio interaccionan con multitud de microorganismos tanto beneficiosos como perjudiciales. Dentro de los microorganismos beneficiosos que interaccionan con las plantas en la rizosfera, destacan por su gran relevancia ecológica y su amplia distribución los hongos micorrícicos arbusculares, que colonizan las raíces de las plantas estableciendo una simbiosis mutualista con la planta denominada micorriza (Gianinazzi et al., 2010; Smith y Read, 2008). Esta simbiosis se encuentra finamente regulada ya que el hongo micorrízico penetra en las células del córtex de la raíz dando lugar a multitud de cambios morfológicos y estructurales en la planta hospedadora. Durante esta simbiosis entre la planta y el hongo se produce un intercambio de nutrientes (Parniske, 2008), sobre todo a nivel de los arbúsculos, por tanto gran parte de los cambios estructurales y morfológicos que experimenta la planta en el transcurso de esta simbiosis están esencialmente ligados a aspectos nutricionales. Además de estos beneficios nutricionales, la formación de la simbiosis también protege a la planta frente a estreses de tipo biótico (ataque de organismos patógenos) (Azcón Aguilar y Barea, 1996; Pozo y Azcón-Aguilar, 2007; Koricheva et al., 2009) y abiótico (salinidad, sequia, frio y presencia de metales pesados, entre otros) (Ruiz-Lozano et al., 2006; Aroca et al., 2007; Ferrol et al., 2009). Para que la planta pueda obtener todos estos beneficios, necesita controlar los niveles de colonización de una manera muy precisa (Slezack et al., 2000), ya que de otra forma la simbiosis podría derivar en una interacción perjudicial para la planta (Catford et al., 2003; Breuillin et al., 2010). En los primeros estadíos de la simbiosis, previos a la colonización, se produce un aumento en la expresión de diferentes genes implicados en la regulación de la respuesta de defensa de la planta (Gallou et al., 2012). Esta activación de la respuesta de defensa de la planta parece indicar, que en los primeros estadíos, la planta reconoce al hongo micorrízico como un potencial agresor y necesita un complejo sistema de señalización para poder determinar el carácter beneficioso del hongo (Pozo y Azcón-Aguilar, 2007; van Wees et al., 2008, Spoel y Dong, 2012; Zamidious y Pieterse, 2012). Algunos de estos genes implicados en la respuesta de defensa de la planta se encuentran regulados por la homeostasis de distintas rutas hormonales (Pozo y Azcón Aguilar, 2007; Ruiz-Lozano et al., 2012). Por tanto la colonización por parte de los hongos micorrízicos implica cambios hormonales relacionados con la defensa de la planta hospedadora. Son muchos los estudios acerca de estos cambios hormonales durante una simbiosis micorrízica arbuscular (AM), pero los resultados obtenidos son altamente controvertidos (revisado en Hause et al., 2007), posiblemente debido a que, si bien la simbiosis AM no muestra una alta especificidad, dependiendo del genotipo de la planta hospedadora y del hongo micorrízico y las condiciones ambientales, el desarrollo de esta simbiosis puede ser diferente (Kiers et al., 2011). A pesar de esta diversidad funcional, hay algunas fitohormonas que presentan un claro papel en esta simbiosis (Hause et al., 2007; Herrera-Medina et al., 2007; Pozo y Azcón-Aguilar 2007). Muchos estudios muestran un posible papel del ácido salicílico (SA) en el control de la colonización del hongo dentro de la planta hospedadora (Pozo y Azcón Aguilar, 2007; Gutjahr y Paszkowski, 2009), debido a su importante papel en la respuesta de defensa de la planta frente a organismos biótrofos (Pieterse et al., 2009). Por tanto debido a que los hongos AM son biótrofos obligados es lógico pensar que el SA pueda ejercer un control sobre la colonización del hongo. Por otro lado el jasmonato (JA) y sus derivados, más conocidos como jasmonatos (JAs), parecen participar activamente en el desarrollo de la simbiosis AM (Hause y Schaarschmidt, 2009, León-Morcillo et al., 2012), debido a que los niveles de JAs se ven incrementados en plantas micorrizadas (Hause et al., 2002; Vierheilig y Piché, 2002; Stumpe et al., 2005; Meixner et al., 2005). Además, muchos estudios muestran que los JAs están relacionados con la respuesta de defensa de la planta frente a organismos necrótrofos, por tanto, este aumento de JAs en las plantas micorrizadas es uno de los beneficios que aportan los hongos AM a la planta hospedadora, reforzando la defensa de la planta frente al ataque de microorganismos necrótrofos (revisado en Jung et al., 2012). Además no solo los niveles de cada una de estas hormonas son importantes para el desarrollo de la simbiosis sino que la interacción entre ambas hormonas puede ser clave para el proceso. En el proceso de señalización entre ambas hormonas tienen un papel importante otras fitohormonas como pueden ser el ácido abscísico (ABA) o el etileno (ET) (Herrera-Medina et al., 2007; Zsogon et al., 2008; Martín-Rodríguez et al., 2010). En el primer capítulo de esta Tesis Doctoral se ha realizado un estudio integrativo de los cambios en la homeostasis de algunas de estas rutas hormonales implicadas en la regulación de la respuesta de defensa de la planta, provocados por la colonización micorrízica. Para esto hemos utilizando los hongos micorrízicos Glomus mosseae y Glomus intraradices, y las plantas hospedadoras tomate, soja y maíz. En este estudio hemos observado diferentes grados de colonización dependiendo del hongo y la planta implicados, confirmando la ¿diversidad funcional¿ observada en otros estudios (Pozo et al., 2002; Feddermann et al., 2008; Kiers et al., 2011). Además los resultados muestran una dependencia del genotipo del hongo y de la planta en la regulación de estas rutas hormonales durante la simbiosis AM. A pesar de esta ¿especificidad¿ en la respuesta de la planta, observamos patrones de regulación conservados en algunas de estas rutas hormonas. La ruta del ABA parece encontrarse inhibida o no alterada en la mayoría de las interacciones llevadas a cabo en este estudio, reforzando lo observado en otros estudios (Martínez-Medina et al., 2011; Aroca et al., 2012; Asensio et al., 2012). La modulación de la ruta del SA mostró una gran variabilidad, siendo altamente dependiente del hongo y la planta hospedadora implicada. Estudios anteriores sugieren que el SA controla el avance del hongo dentro de la raíz. Nuestro trabajo sugiere que los niveles de SA dependen de la fase en la que se encuentre el proceso de micorrización en las diferentes intercciones estudiadas (Herrera-Medina et al., 2003; Khaosaad et al., 2007; Campos-Soriano y Segundo, 2011). Uno de los efectos más claros observados en este estudio es un patrón de regulación del JA muy conservado entre las plantas y altamente dependiente del hongo. La colonización por G. mosseae produjo un aumento de los niveles de JA, en las diferentes especies de plantas estudiadas, mientras que G. intraradices no desencadenó ningún cambio significativo en los niveles de JA. Este patrón de regulación del JA podría explicar la mayor capacidad de bio-protección por parte de G. mosseae comparado con G. intraradices (Pozo y Azcón-Aguilar, 2007). Debido a la alta conservación del patrón de regulación de la ruta del JA en las planta micorrizadas, en el segundo capítulo de esta Tesis Doctoral, decidimos profundizar en el estudio de este patrón de regulación. En este trabajo se realizó un estudio más exhaustivo de los niveles de los distintos derivados del JA, así como un análisis de los niveles de expresión de múltiples genes implicados tanto en la biosíntesis como en la percepción de los diferentes derivados del JA. Los resultados muestran un aumento en el precursor del JA ácido (9S, 13S)-12-oxo-fitodienoico (OPDA), que se encuentra aguas arriba en la ruta de biosíntesis del ácido jasmónico. Sin embargo, los niveles de JA libre o su conjugado jasmonato-isoleucina, no se vieron alterados en este estudio. Estos datos sugieren que el OPDA podría estar orquestando el proceso de micorrización en la familia de las solanáceas y no las otras formas de JA (Hause et al., 2002; Stumpe et al., 2005). Además, el estudio de los niveles de expresión de genes implicados en la ruta de biosíntesis de las oxilipinas, sugieren que durante el proceso de micorrización la planta redirige esta ruta hacia la biosíntesis de diferentes formas de OPDA pertenecientes a las dos principales ramas de la ruta de biosíntesis del JA (9-LOX y 13-LOX). Todos estos datos confirman la importancia de la ruta de los JAs durante el proceso de micorrización. Además de los JAs, se han descrito otras hormonas muy importantes para el proceso de micorrización. Las estrigolactonas son consideradas nuevas hormonas vegetales con un importante papel en la señalización para el establecimiento de una simbiosis AM (Akiyama et al., 2005; Parniske, 2008). Por este motivo en el tercer capítulo de esta Tesis Doctoral, analizamos los niveles de estrigolactonas en plantas de tomate micorrizadas. Nuestros estudios mostraron un claro descenso en la producción de los principales tipos de estrigolactonas en las plantas micorrizadas. Estos resultados parecen indicar que una vez establecida la simbiosis AM, la planta hospedadora modula la señalización en la raíz para limitar la interacción con nuevos hongos micorrízicos. Para estudiar con más detalle el papel de los JAs en la micorrización en el cuarto capítulo de esta Tesis Doctoral, realizamos un estudio del proceso de micorrización mediante el uso de diferentes mutantes en la biosíntesis/percepción del JA (Schilmiller and Howe, 2005; Wasternack et al., 2006), asi como en la biosíntesis de prosistemina (PS). La PS es un propéptido a partir del cual se origina la sistemina (Sys), una hormona peptídica con un papel importante en la regulación de la biosíntesis de los JAs, actuando aguas arriba de esta ruta (McGurl et al., 1992; Bergey et al., 1996). Curiosamente solo se observaron cambios significativos en los niveles de colonización en los mutantes con los niveles de PS alterados. ps+ (sobreexpresante de PS) mostró un mayor grado de colonización, mientras que ps- (mutante con la producción de PS comprometida) fue incapaz de de establecer una simbiosis AM. Mediante un estudio más exhaustivo de los mutantes de PS, pudimos determinar por primera vez que la raíz de tomate es capaz de expresar el gen que codifica para la PS. Hasta el momento la expresión del gen que cofifica para la PS solo se había descrito en la parte aérea de algunas solanáceas (McGurl et al., 1992; Narvaez-Vasquez y Ryan, 2004; Wasternack et al., 2006). Además, nuestro estudio reveló que la expresión de PS en la raíz es clave para el establecimiento de una simbiosis AM. Esta función de la PS en el establecimiento de una simbiosis AM parece ser independiente del JA, ya que los diferentes mutantes de JA usados en este estudio mostraban unos niveles de colonización similares a las plantas silvestres. Nuestros estudios in vitro mostraron que la PS actúa en el proceso de señalización durante la colonización AM, ya que mediante el uso de raíces ps- pudimos observar un menor desarrollo del micelio extraradical del hongo así como una menor germinación de las esporas, sugiriendo que la PS tiene un papel en el dialogo presimbiótico que tienen lugar entre la planta hospedadora y el hongo AM. Este papel de la PS en el dialogo presimbiótico podría ser través de la regulación de la biosíntesis de las estrigolactonas en la planta hospedadora, ya que los mutantes ps- mostraron niveles reducidos de las principales estrigolactonas, mientras que ps+ mostraba un aumento en los niveles de estas. Debido a estas alteraciones en los niveles de estrigolactonas y al importante papel de estas en la comunicación entre la planta y el hongo, sugerimos que la PS controla el establecimiento de la simbiosis AM mediante la regulación de la biosíntesis de las estrigolactonas. Además de esta función en el proceso de señalización durante la simbiosis, pudimos observar que la PS también tiene un papel en la regulación de la arquitectura radical, ya que las raíces de los mutantes ps- y ps+ mostraron variaciones en tamaño de la raíz principal, así como en el número de raíces secundarias y su tamaño. Es posible que la PS pueda realizar estos cambios mediante la regulación de la biosíntesis de las estrigolactonas, pues el papel de estas en la arquitectura radical está ampliamente descrito (Kapulnik et al., 2011; Ruyter-Spira et al., 2011). Por último en el quinto capítulo de esta Tesis Doctoral tratamos de profundizar en la regulación del gen de la PS en la raíz de tomate. En nuestro estudio observamos que la PS se regula transcripcionalmente en la raíz de forma similar a la PS expresada en la parte aérea. Los niveles de expresión de PS en raíz incrementaron tras la el tartamiento con herida y la aplicación de metil-jasmonato (MeJA). Además la expresión de PS en raíz fue modulada tras la interacción con diferentes hongos del suelo, en función de los componentes de la pared celular. Este resultado apunta a un papel de la PS en los primeros estadíos de la interacción de la planta con diferentes hongos del suelo. Además la elicitación de la raíz con diferentes moléculas implicadas en los procesos de señalización temprana, factores myc y oxido nítrico, dieron como resultado el incremento en los niveles de expresión del gen que codifica para la PS, reforzando la idea de que la PS tiene un papel en los procesos de señalización en los primeros estadios de la interacción de la planta con diferentes microorganismos. Debido a las importantes funciones de la PS en las plantas de tomate decidimos buscar péptidos de señalización homólogos a la PS en especies alejadas filogenéticamente de las solanaceas. En nuestro estudio observamos que GmProPep914, que es un propéptido presente en soja (Yamaguchi et al., 2011), se regulaba de manera similar a la PS, aumentando su nivel de expresión tras la aplicación de MeJA, herida y durante una simbiosis AM. Con el fin de determinar si el ProPep914 es el homologo en soja a la PS en tomate, en futuros trabajos estudiaremos el proceso de colonización micorrízica en líneas mutantes de soja con la biosíntesis de este propéptido comprometida. Por otro lado, ampliaremos la búsqueda de estos homologos en especies de plantas alejadas filogenéticamente como pueden ser las monocotiledóneas, ya que recientemente se ha sugerido que ZmPep1 podría ser un homologo a la PS en maíz (Huffaker et al., 2011). Además en futuros trabajos intentaremos profundizar en el estudio de los mecanismos por los cuales la PS regula el establecimiento de la simbiosis AM, así como su papel en la regulación de la biosíntesis de los JAs.