El sistema de señalización de la reelina en la homeostasis y en la inflamación del colon

Resumen

En 1951, Falconer describió por primera vez un tipo de ratones mutantes espontáneos a los que denominó reeler, los cuales presentaban una mutación autosómica recesiva que les provocaba anormalidades arquitectónicas severas en la corteza cerebral. En 1995 se clonó el gen que codifica la Reelina y se descubrió que el ratón “reeler” no expresaba Reelina (D’Arcangelo y cols., 1995). La Reelina es una glicoproteína de la matriz extracelular de gran tamaño (420 KDalton) fundamental para la regulación de la migración y posicionamiento de las neuronas, células de la glía y astrocitos durante el desarrollo embrionario, regulando la laminación de la corteza cerebral, el hipocampo y el cerebelo. En el cerebro adulto participa en el mantenimiento de la conectividad y plasticidad sináptica, responsables del desarrollo cognitivo (ver revisión Folsom y Fatemi, 2013). Para ejercer su acción la Reelina se une a los receptores de membrana VldlR (receptores de lipoproteínas de muy baja densidad), ApoER2 (receptor 2 de la apolipoproteína E), entre otros, e induce la fosforilación de su proteína efectora citosólica Dab1 (Disabled 1). La Reelina se expresa principalmente en el cerebro y en menor cantidad en tejidos adultos periféricos. Nuestro grupo de investigación describió por primera vez la presencia de Reelina en los miofibroblastos de la mucosa del intestino delgado (García-Miranda y cols., 2010), y su función en la regulación de la dinámica cripta-vellosidad (García-Miranda y cols., 2013). Posteriormente otros autores han corroborado la expresión de Reelina en el tejido intestinal (Saaed y cols., 2012; Xiong y cols., 2013). La función de la Reelina en los tejidos periféricos es desconocida, aunque hay datos que parecen indicar que está implicada en el desarrollo de los tejidos y en su reparación tras el daño tisular (Pulido y cols., 2007; Lorenzetto y cols., 2008; Won y cols., 2006; Courtès y cols., 2011; Rebustini y cols., 2012). Enfermedades inflamatorias intestinales Las enfermedades inflamatorias intestinales constituyen un problema sanitario cuya incidencia ha ido incrementándose en los últimos años. Principalmente incluye dos patologías: la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Aunque la etiología de las enfermedades inflamatorias intestinales es desconocida, estudios recientes indican que se debe a la interacción de distintos factores, tales como la susceptibilidad genética, las condiciones ambientales externas, la flora microbiana intestinal y la respuesta inmune (ver revisión Zhang y Li, 2014). Estudios recientes han identificado una gran variedad de genes asociados a las enfermedades inflamatorias intestinales (Jostins y cols., 2012). Durante las dos últimas décadas la mayoría de los estudios sobre la respuesta inmunitaria en las enfermedades inflamatorias intestinales se han centrado en la respuesta inmune adaptativa, sin embargo, las investigaciones más recientes lo hacen en la respuesta inmune innata de la mucosa durante la inflamación aguda o en la primera fase de la inflamación crónica. En este tipo de respuesta desempeña una función fundamental la barrera intestinal que forma el epitelio, el moco que recubre el epitelio, los enterocitos/colonocitos y las células especializadas en la defensa e inflamación como las células de Paneth y los neutrófilos (ver revisión Zhang y Li, 2014). La enfermedad inflamatoria intestinal se caracteriza por una desregulación de la homeostasis epitelial. Las células epiteliales se comunican con las células mesenquimales que las rodean, entre las que se incluyen los miofibroblastos, a través de cascadas de señalización de citoquinas inflamatorias u otras moléculas, y alteraciones en estas vías pueden producir patologías intestinales. Implicación de la Reelina en procesos patológicos y en la regeneración tisular En el hombre existen múltiples enfermedades neurológicas que se han relacionado con el gen de la Reelina o con los componentes de su vía de señalización, como la esquizofrenia, el autismo, el Alzheimer, la lisencefalia, el trastorno bipolar, el desorden depresivo mayor (ver revisión Folsom y Fatemi, 2013) y la epilepsia (Haas y Frotscher, 2010; Dazzo y cols., 2015). En casi todas ellas la expresión de la Reelina se encuentra reducida. También ha sido relacionada con procesos patológicos periféricos, como la enfermedad de Hirschprung, donde la Reelina se encuentra aumentada (Saeed y cols., 2012). La expresión de Reelina también se encuentra alterada en el desarrollo de algunos cánceres. En el cáncer de mama (Stein y cols., 2010), en el gástrico (Dohi y cols., 2010), en el pancreático (Sato y cols., 2006) y en el carcinoma hepatocelular (Okamura y cols., 2011) la Reelina está disminuida, en cambio los niveles aumentan en el cáncer de próstata (Perrone y cols., 2007) y en el retinoblastoma (Seigel y cols., 2007). Wang y cols. (2002) observaron un aumento en la expresión de Cask y Reelina en el cáncer de esófago mientras que Yuan y sus cols. (2012) describieron una disminución de la Reelina por acción del TGFβ1 en este mismo tipo de cáncer. También ha sido relacionada con procesos inflamatorios así, en la artritis reumatoide la Reelina está aumentada (Magnani y cols., 2010) y disminuye en el cerebro de embriones de ratones gestantes cuyas madres han sido sometidas previamente a inflamación cerebral (Harvey y Boksa, 2012). La infección por rotavirus de las células Caco-2 induce un aumento de la expresión del ARNm de Reelina (Cuadras y cols., 2002). Se han observado aumentos en la expresión de la Reelina tras lesión de distintos tejidos, sugiriendo su participación en la reparación/regeneración de los tejidos dañados. Es el caso de lesiones en la córnea y la retina (Pulido y cols., 2007), en la mielina del nervio periférico (Lorenzatto y cols., 2008), tras isquemia y daño cerebral (Won y cols., 2006; Courtès y cols., 2011) y en la regeneración de la glándula submandibular (Rebustini y cols., 2012). OBJETIVOS Nuestro grupo de investigación identificó por primera vez los componentes del sistema de señalización de la Reelina (Reelina, VldlR, ApoER2 y Dab1) en el intestino delgado de rata y ratón y demostró que las proteínas Reelina y Dab1 están implicadas en la dinámica del eje cripta-vellosidad. Otros resultados observados en los ratones reeler (deficientes en Reelina) mostraban: i) alteraciones en la morfología de la mucosa del intestino delgado observándose mayor anchura de las uniones adherentes, lo que podría permitir el acceso de antígenos de la luz intestinal; ii) una disminución en el número de células Paneth, que reduciría la defensa antimicrobiana intestinal; y iii) variaciones en la expresión de genes implicados en la respuesta inmune e inflamación. Todo ello nos hizo pensar que la Reelina podría tener una función en las patologías intestinales. Por lo anteriormente expuesto, el objeto del presente trabajo es estudiar la expresión, función y regulación del sistema de señalización de la Reelina en la mucosa del colon normal e inflamado de ratón, de acuerdo con el siguiente plan de trabajo: 1. Expresión de los genes Reelina, Dab1, VldlR y ApoER2 en la mucosa del colon de ratón, y el efecto de la edad sobre dicha expresión. 2. Localización de las proteínas Reelina, VldlR, ApoER2 y Dab1 en las células de la mucosa del colon de ratón. 3. Análisis de la morfología y homeostasis de la mucosa del colon de ratón en presencia y ausencia de la Reelina. 4. Efecto de la ausencia de la Reelina en la expresión de los genes SOX9, Ciclina D1, Cdx-2, Smad5, Hes-1 y Atoh-1 en el colon de ratón. 5. Efecto del tratamiento con un agente inflamatorio en la expresión de Reelina, Dab1, VldlR y ApoER2. 6. Análisis del grado de inflamación en el colon de ratones control y reeler. 7. Efecto de la inflamación en la expresión de los genes SOX9, Ciclina D1, Cdx-2, Smad5, Hes-1 y Atoh-1 en el colon de ratones control y reeler. 8. Regulación de la expresión de la Reelina en el colon de ratón durante la inflamación. CONCLUSIONES 1. La mucosa del colon de ratón expresa las proteínas Reelina, sus receptores VldlR y ApoER2 y su proteína efectora Dab1. 2. La Reelina desempeña funciones a lo largo del intestino principalmente en edades más tempranas, mientras que la Dab1 realiza funciones más relevantes en el intestino delgado en todas las edades estudiadas. 3. La Reelina en la mucosa del colon sólo se expresa en los miofibroblastos, mientras que el resto de componentes del sistema se expresa en los colonocitos y en los miofibroblastos. 4. La ausencia de Reelina disminuye la profundidad y diámetro de las criptas, el grosor de la capa muscular del colon y el grosor de las microvellosidades, y aumenta la longitud de las microvellosidades y el espacio intercelular de los desmosomas del epitelio del colon. 5. La Reelina regula la dinámica del epitelio del colon activando la proliferación, migración, diferenciación y apoptosis celular. 6. La mutación del gen Reelina disminuyó la expresión de los factores de transcripción SOX9 y Cdx-2, sugiriendo que la Reelina regula los procesos de homeostasis del epitelio del colon a través de estos genes pertenecientes a la vía de señalización Wnt. 7. La inflamación inducida con DSS aumenta la abundancia del ARNm y de la proteína Reelina debido a un aumento de su expresión génica en los miofibroblastos de la mucosa del colon. 8. El aumento en la expresión de Reelina durante la inflamación del colon, se produce principalmente por hipometilación de su promotor, debido, entre otros factores, a la disminución de la expresión de la enzima ADN metiltransferasa 1 (DNMT1). 9. La disminución en la expresión de la ADN metiltransferasa 1, durante la inflamación, puede ser debida a un aumento en la expresión del factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1) sugiriendo que el efecto antiinflamatorio de esta citoquina podría estar mediado, al menos en parte, por la Reelina. 10. Los ratones reeler son más susceptibles a la inflamación inducida con DSS, lo que sugiere que la Reelina ejerce una acción protectora en la mucosa del colon. 11. En los ratones reeler, el tratamiento con DSS en el colon aumenta la expresión de los genes implicados en la proliferación y migración celular, Ciclina D1 y Smad-5, pertenecientes a las vías de señalización Wnt y BMP, respectivamente, sugiriendo que la Reelina puede participar en el proceso de reparación del tejido dañado.