Estudio en pacientes con obesidad mórbida de los factores relacionados con la señalización hepática de leptina, adiponectina e insulina y su relación con la progresión del hígado graso no alcohólico

Resumen

Título de la tesis doctoral. Estudio en pacientes con obesidad mórbida de los factores relacionados con la señalización hepática de leptina, adiponectina e insulina y su relación con la progresión del hígado graso no alcohólico. Introducción y resumen de antecedentes bibliográficos. La obesidad es una enfermedad crónica multifactorial, cuya prevalencia ha aumentado y continúa aumentando alarmantemente en nuestra sociedad, así como en países en economía en transición, hasta adquirir proporciones epidémicas. Entre las repercusiones clínicas más importantes se encuentra el síndrome metabólico y su exponente hepático, la enfermedad del hígado graso no alcohólica (EHGNA). Nuestro trabajo doctoral se centra en el estudio de los mecanismos implicados en el origen y progresión de la EHGNA en obesidad mórbida. La prevalencia de la EHGNA ha aumentado rápidamente en paralelo al dramático incremento de la obesidad y la diabetes tipo 2, tanto en la población adulta como pediátrica, por lo que la EHGNA representa la causa más común de enfermedad hepática en el mundo occidental, siendo motivo de preocupación su diagnóstico precoz, estadiaje y tratamiento para evitar la progresión de esta enfermedad a cirrosis hepática y sus complicaciones. La hipótesis del doble impacto se propuso en la década de los 90 como un modelo para explicar el origen de la esteatosis hepática y su posterior evolución hacia esteatohepatitis. La acumulación de lípidos en los hepatocitos (primer impacto) desencadenaría una serie de eventos citotóxicos (segundo impacto) que culminarían en esteatohepatitis. Este punto de vista inicial ha evolucionado y, en la actualidad, el origen de la esteatosis hepática y su posterior evolución hacia esteatohepatitis se considera un proceso multifactorial en el que los mecanismos más relevantes pueden variar de un paciente a otro, probablemente debido a una combinación de factores genéticos y ambientales. En el caso de la EHGNA ligada a la obesidad mórbida los mecanismos más relevantes se asocian a una alteración funcional y endocrina del órgano graso. El concepto multifactorial de la EHGNA está bien establecido y se conocen los principales mecanismos implicados, siendo la resistencia a insulina uno de los mecanismos centrales. Sin embargo, a una escala más molecular, existen numerosas lagunas sobre las alteraciones que sufre el tejido hepático durante el origen y progresión de la EHGNA. La adiponectina es la adipoquina más abundante y específica del tejido adiposo. Cada vez hay más evidencia del papel hepatoprotector de la adiponectina en hígado graso no alcohólico. A nivel hepático, la adiponectina incrementa la sensibilización a insulina y posee actividad antifibrogénica - anti-inflamatoria, actuando en los hepatocitos y macrófagos hepáticos (células de Kupffer), respectivamente. El efecto hepatoprotector de la adiponectina y su acción insulinosensibilizante hacen que la adiponectina y el estudio de su fisiología a través de sus receptores hepáticos sean un atractivo potencial terapéutico en el HGNA. Hay datos contradictorios con respecto a la expresión de los receptores AdipoR1 y AdipoR2 en hígado graso no alcohólico. Por una parte, se ha publicado que los niveles de expresión génica del receptor AdipoR2 hepático disminuyen en pacientes con EHNA, en comparación con los controles. Sin embargo, otros estudios no han encontrado variaciones en la expresión génica en la progresión del HGNA, o por lo contrario se ha publicado que el nivel de expresión génica de dichos receptores aumenta o aumenta sólo la isoforma AdipoR2. En estos datos anteriormente indicados pueden influir factores de confusión relacionados con diferencias anatomoclínicas entre individuos de las cohortes estudiadas o diferencias metodológicas sobretodo en la utilización de genes de normalización (housekeeping) para cuantificar la expresión génica de receptores de adiponectina no específicos a nivel hepático. En la progresión del HGNA a esteatohepatitis y fibrosis hepática, la teoría del doble impacto formulada por Day menciona la implicación de las vías de estrés oxidativo y RI como factores determinantes. En un estudio anterior y mediante la utilización de un modelo de ratones obesos y diabéticos, se ha demostrado sobre-expresión de AdipoR2, que a su vez se demuestra incrementada en relación con la expresión de enzimas antioxidantes hepáticas. También se ha demostrado la conexión entre la expresión génica de receptores de adiponectina y vías del estrés oxidativo en modelos celulares. No se han realizado estudios similares en modelos humanos. La leptina es una hormona pleiotrópica que en hígado induce inhibición de la lipogénesis, síntesis de glucosa, estimulación de la beta oxidación y la sensibilidad a insulina, y en hipotálamo presenta una función anorexígena, sin embargo, la obesidad está fuertemente asociada con esteatosis hepática y resistencia a insulina. De las cuatro isoformas celulares descritas para el receptor de leptina, las más abundantes son OB-Ra, que es mayoritario en todos los tejidos estudiados salvo el hipotálamo y OB-Rb, que es la isoforma predominante en hipotálamo. En cuanto al resto de las isoformas cortas, son minoritarias y muy pocos trabajos han analizado sus niveles de expresión. Respecto a la función de las isoformas celulares del receptor en la señalización de la leptina, únicamente la isoforma larga posee los dominios necesarios para conectar con las vías intracelulares de transducción JAK-STAT, pero también con las vías MAPK y PI3K. Existen fuertes argumentos a favor de que el hígado graso también desarrolla resistencia a leptina, sin embargo, las bases moleculares de la resistencia a hepática a leptina son en la actualidad desconocidas. En contrapartida, la resistencia a leptina a nivel del hipotálamo está bien establecida. Se sabe que es la responsable de la pérdida del efecto anorexiante de la hormona en individuos obesos y se conocen los principales mecanismos moleculares implicados: la disminución de los niveles de expresión del receptor de leptina y el incremento de los niveles de SOCS-3. La resistencia a insulina altera profundamente el metabolismo glucídico del hígado, dificultando la síntesis de glucógeno durante el periodo postprandial. La disminución de las reservas de glucógeno hepático se asocia a un incremento en la actividad de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (enzima clave en el metabolismo del glucógeno) que, unido al fallo en la señalización de insulina, provoca un incremento de la producción hepática de glucosa en ayuno. Leptina e insulina comparten vías de señalización en los hepatocitos. La proteína JAK2, que se activa por el receptor de leptina, activa a su vez las proteínas IRS, claves en la señalización de insulina. Los entrecruzamientos en las vías de señalización endocrinas son muy frecuentes. De hecho, el número de vías de transducción diferentes que tiene la célula es inferior al número de receptores hormonales de la membrana plasmática. En consecuencia, la modulación final de las vías intracelulares de transducción es resultado de la integración de numerosas señales procedentes de uniones de hormonas a sus respectivos ligandos en la superficie celular. Aunque es conocido que SOCS-1 y SOCS- 3 son un represores de la señalización de insulina y leptina, su papel preciso en el hígado graso no está claro. En estudios in vivo con ratones deficientes en SOCS-1 se ha publicado que aumenta la expresión de IRS-2 y mejora la sensibilidad a insulina intrahepática. La lipogénesis hepática se incrementa en pacientes obesos con resistencia a insulina. Este es un dato contradictorio ya que la lipogénesis es una de las consecuencias de la señalización de insulina en los hepatocitos. Esta contradicción aún no ha sido completamente explicada. Algunos autores opinan que las diferentes rutas de señalización activadas por la insulina en el hígado se alteran independientemente, de forma que la resistencia hepática a insulina afectaría con más intensidad al metabolismo glucídico que al lipídico, lo que unido a la hiperinsulinemia y a la hiperlipidemia, habituales en pacientes con síndrome metabólico, favorecería laesteatosis hepática. La elevada entrada de lípidos así como la lipogénesis de novo a través de la glicólisis por la vía acetil CoA, parecen ser los puntos clave para la acumulación de lípidos en los hepatocitos. Se ha estudiado que SREBP-1c, controla la lipogénesis de novo en el hepatocito, principalmente a través de la regulación de la expresión de genes implicados en ésta, en el metabolismo de los lípidos y en la homeostasis de la glucosa. Por consiguiente, la expresión hepática de SREBP-1c y sus genes diana está incrementada en pacientes con EHGNA en comparación con los individuos sanos. Aunque en condiciones de resistencia a insulina SREBP-1c no debería ser activado, sorprendentemente la hiperinsulinemia estimula la expresión de SREBP-1c, incluso en estados de intensa resistencia a la insulina, dando lugar a un incremento de lipogénesis de novo. Durante la obesidad mórbida, la expresión hepática de genes asociados a la señalización de leptina, insulina y metabolismo lipídico cambian en relación con el origen y progresión de la EHGNA, los cuales pueden formar parte de mecanismos de resistencia hepática a leptina e insulina, claves para la progresión de esta enfermedad. Los antecedentes citados en la fisiopatología de la EHGNA y su progresión en relación con las adipoquinas leptina y adiponectina, factores relacionados con resistencia a insulina y factores relacionados con inflamación, entre otros factores, sugieren un cambio en la expresión hepática de los mecanismos de señalización de los factores citados, que contribuyen al origen y progresión del HGNA, así como al desarrollo de síndrome metabólico. Los antecedentes citados en relación con los marcadores de estrés oxidativo "(sobretodo glutation peroxidasa)" y los mecanismos de señalización de adipoquinas (receptores de adiponectina) en la progresión del HGNA, sugieren un vínculo entre los receptores de adiponectina y las vías de estrés oxidativo. Hipótesis de trabajo. De los antecedentes expuestos derivan las siguientes hipótesis de trabajo: - Los cambios en la expresión hepática de los receptores de adiponectina en la progresión de la EHGNA pueden estar asociados con la expresión de genes relacionados con el estrés oxidativo, lo que nos permitiría profundizar en el conocimiento de la señalización hepática de la adiponectina y sus alteraciones en la progresión de la EHGNA. - Durante la obesidad mórbida, la expresión hepática de genes asociados a la señalización de leptina, insulina y metabolismo lipídico cambia en relación con el origen y progresión de la EHGNA. Los mecanismos de señalización hepática de leptina e insulina comparten factores moleculares que se alteran con el inicio y progresión de la enfermedad y podrían explicar mecanismos de resistencia hepática a leptina e insulina. - Durante el origen y la progresión de la EHGNA, los incrementos de expresión de perilina 1 y adipofilina se podrían relacionar con la expresión de genes asociados a la señalización hepática de adiponectina, leptina e insulina, identificando elementos clave de resistencia endocrina. Objetivos. Para la validación de las hipótesis de trabajo, antes expuestas, nuestro estudio se ha estructurado en los siguientes objetivos concretos: 1) Valorar la presencia y progresión de la EHGNA a partir de biopsias hepáticas,según el método de Kleiner. 2) Evaluar parámetros bioquímicos relacionados con perfil hepático, resistencia ainsulina, metabolismo lipídico y adipoquínas, así como marcadores de estrésoxidativo en sangre durante el orígen y progresión de la EHGNA. 3) Evaluar, mediante técnicas de RT-PCR a tiempo real, la expresión de una seriede genes asociados a la señalización de adiponectina, leptina, insulina, proteinasPAT, metabolismo lipídico y estrés oxidativo en biopsias hepáticasintraoperatorias realizadas a pacientes con obesidad mórbida sometidos a cirugíabariátrica en el Hospital Universitario San Cecilio de Granada. 4) Establecer un vínculo entre los niveles de receptores de adiponectina hepáticosy el nivel de estrés oxidativo hepatocitario en distintos estadios de la EHGNAmediante la medición de niveles sanguíneos de marcadores de estrés oxidativo,así como la cuantificación del nivel de expresión génica de enzimas relacionadascon el estrés oxidativo: GPX1, GRD e iNOS, en biopsias hepáticas realizadas ala cohorte de pacientes citada. 5) Establecer un vínculo entre los niveles de expresión hepática de los genesasociados a señalización de leptina, insulina y metabolismo lipídico durante elorigen y progresión de la EHGNA, cuantificando estos niveles en las biopsiashepáticas realizadas a la cohorte de pacientes citada. 6) Establecer un vínculo entre los niveles de expresión de proteínas PAT y losgenes medidos anteriormente con la intención de identificar marcadores clavesde resistencia hepática endocrina. 7) Valorar la evolución de la actividad de adiponectina a nivel plasmático,marcadores sanguíneos relacionados con el síndrome metabólico (glucosa,triglicéridos, colesterol total, HDL, insulina, HOMA-IR), marcadores de perfilhepático (transaminasas y GGT) y marcadores sanguíneos de estrés oxidativotras la cirugía bariátrica mediante la realización de análisis de sangre a la cohortede pacientes citada un año después de la cirugía. Descripción de la cohorte de estudio. Se ha realizado un primer estudio de corte transversal en el que se han incluido 60 sujetos, en total 18 hombres y 42 mujeres, con obesidad mórbida (IMC > a 40Kg/m2), sometidos a cirugía bariátrica en el Hospital Universitario San Cecilio (Granada, España). Se ha realizado segundo estudio observacional, analítico, con seguimiento de la cohorte de pacientes citada (al final del estudio han quedado 42 pacientes), a los que se ha realizado una valoración estadística de la evolución del IMC y parámetros plasmáticos: glucosa e insulina, leptina y adiponectina, perfil hepático, perfil lipídico yde estrés oxidativo; antes y un año después de la cirugía. Se ha realizado un tercer estudio en un modelo celular in vitro de esteatosis hepática para verificar algunos datos obtenidos en la cohorte de pacientes en relación a la asociación entre adipofilina y SOCS-1.Los criterios de exclusión para los estudios que han incluido a la cohorte de pacientes han sido: los trastornos hepáticos primarios, además de aquellos que presentan EHGNA secundario a patologías como la deficiencia de alfa-1-antitripsina, la hepatitis infecciosa o enfermedad de Wilson, identificados por los marcadores de la enfermedad específica. El consumo de alcohol máximo permitido en los participantes del estudio ha sido como máximo de 30 g por semana en hombres y 20 g por semana en las mujeres. El comité de ética del Hospital Universitario San Cecilio ha aprobado el estudio y todos los sujetos han aceptado y firmado el consentimiento informado escrito. Breve descripción de la metodología experimental empleada. Para el estudio de corte transversal las biopsias hepáticas han sido obtenidas en el momento de la cirugía bariátrica. Para el estudio observacional, analítico, con seguimiento de la cohorte se han tomado muestras de sangre antes de la cirugía, después de 10 horas de ayuno postoperatorio y un año después de la cirugía. Para el diseño del estudio de modelo celular se han utilizado cultivos de la línea celular establecida llamada PLC-PRF-5 (hepatocarcinoma humano), que sintetizan en la superficie el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg). Para la determinación de los parámetros bioquímicos, las muestras de sangre han sido procesadas y analizadas por métodos de rutina dentro de las 24 horas siguientes a la extracción en el laboratorio de Análisis Clínicos del Hospital Universitario San Cecilio. En cada paciente, se han analizado los niveles de glucosa (mg / dl), insulina (mU / ml), triglicéridos (mg / dl), colesterol total (mg / dl), lipoproteínas de baja densidad (LDL) colesterol (mg / dl), lipoproteínas de alta densidad ( HDL), colesterol (mg / dl), alanina aminotransferasa (ALT) (U / l), aspartato aminotransferasa (AST) (U / l) y gamma glutamiltransferasa (GGT) (U / l). En todos los pacientes se ha calculado el índice HOMA-IR, que permite realizar estimaciones de resistencia insulínica y función de las células beta pancreáticas. Los niveles de adiponectina y leptina en plasma se han medido utilizando el kits comerciales y siguiendo las instrucciones del fabricante. Los niveles de estrés oxidativo sanguíneo se han determinado mediante técnicas espectrofotométricas utilizadas ampliamente en investigación. Para el estudio anatomopatológico, todas las biopsias hepáticas han sido evaluadas por un único patólogo con experiencia utilizando el sistema de puntuación validada por Kleiner. Este sistema de puntuación histológico cuantifica los cambios de actividad necroinflamatoria y esteatósicos (esteatosis, inflamación lobular y balonización), dando lugar a resultados para actividad de EHGNA que oscilan entre 0 y 8. Las puntuaciones mayores o iguales a 5 han sido diagnosticadas como hígado graso, las puntuaciones entre 3 y 4 han sido diagnosticadas como probable o clara esteatohepatitis, las puntuaciones de 1 y 2 han sido diagnosticadas como hígado graso sin inflamación, y la puntuación 0 fue diagnosticada como no EHGNA. En función de esta puntuación los pacientes fueron divididos en tres grupos: Grupo 0. Pacientes obesos mórbidos sin EHGNA. Grupo 1. Pacientes obesos mórbidos con EHGNA pero sin esteatohepatitis. Grupo 2. Pacientes obesos mórbidos con probable o clara esteatohepatitis. El estudio de expresión de genes asociados a la señalización hepática de adiponectina, leptina e insulina, se ha desarrollado mediante la técnica de Real Time RT-PCR. Se han utilizado kits comerciales para la extracción del RNA total hepático, para su retrotranscripción a cDNA y para el seguimiento, en tiempo real, de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se ha utilizado una plataforma de PCR a tiempo real: CFX96 Real Time System de BioRad. El modelo in vitro de esteatosis hepática se ha desarrollado en cultivos de la línea celular PLC-PRF-5 (hepatocarcinoma humano), que sintetizan en la superficie el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) (sólo antígeno). Durante el trascurso de los experimentos la confluencia celular inicial ha oscilado entre el 60 y el 70%, y se han añadido al medio de cultivo concentraciones de ácido oleico entre 0,125 y 2 mM. Para favorecer la solubilidad del ácido oleico en el medio de cultivo se ha suplementado con un 0,1% de albúmina. Los métodos para medir la expresión de genes en cultivo celular han sido idénticos a los empleados en biopsias hepáticas. Con la salvedad de pequeñas modificaciones a la hora de extraer el RNA El análisis estadístico de los datos se ha realizado mediante el Paquete Estadístico para Ciencias Sociales (SPSS 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Conclusiones. La expresión hepática de las dos isoformas del receptor de adiponectina, ADIPOR1 y ADIPOR2, se incrementa con el origen y desarrollo de la EHGNA en obesos mórbidos, en estrecha correlación con genes pertenecientes a los mecanismos de defensa antioxidante, especialmente con la glutatión peroxidasa. Nuestros datos sugieren la existencia de factores de transcripción comunes a las isoformas del receptor de adiponectina y a genes de la maquinaria antioxidante. La expresión de las isoformas del receptor hepático de leptina se correlaciona con la expresión de genes clave en la señalización de insulina. Los niveles de correlación más intensos se aprecian en el grupo de pacientes obesos sin EHGNA. Estos datos sugieren que la sinergia parcial existente entre las rutas de señalización hepática de leptina e insulina se refleja también en los mecanismos de expresión genética de las proteínas implicadas en dicha señalización. Las expresiones hepáticas de adipofilina y SOCS-1 se correlacionan únicamente en pacientes obesos con EHGNA. Estos datos han sido verificados en un modelo celular de esteatosis hepática. En dicho modelo, laexpresión de adipofilina se correlaciona de forma casi absoluta con el contenido extracelular de ácidos grasos y muestra una correlación fuerte con la expresión de SOCS-1. Nuestros datos sugieren que SOCS-1 podría estar implicada en los mecanismos hepáticos de resistencia endocrina que se desarrollan en el hígado graso. Bibliografía relevante. Cole TJ, Bellizi MC, Flegal KM, et al. Establishing a standard definition for child overweight and obesity worldwide: international survey. BMJ. 2000; 320:1240-3. Aranceta Bartrina J, Serra Majem L, Pérez Rodrigo C, et al. Prevalencia de obesidad en España. Med Clin (Barc). 2005; 125: 460-6. Lorenzo C, Serrano-Ríos M, Martínez-Larrad MT, et al. Central adiposity determines prevalence differences of the metabolic syndrome. Obes Res. 2003; 11:1480-7. Galic S, Oakhill JS, Steinberg GR. Adipose tissue as an endocrine organ. Molecular and Cellular Endocrinology. 2010; 316(2): 129-39. Liu M, Liu F. Transcriptional and post-translational regulation of adiponectin. Biochem J. 2009;425(1):41-52 Machado M, Marques-Vidal P, Cortez- Pinto H. Hepatic histology in obese patients undergoing bariatric surgery. J Hepatol 2006; 45: 600¿6. Day CP, James OF. Steatohepatitis: a tale of two ``hits¿¿? Gastroenterology 1998; 114: 842¿5. Angulo P. Long-term mortality in nonalcoholicfatty liver disease: is liver histologyof any prognostic significance?. Hepatology 2010; 51: 373¿5. Kleiner DE, Brunt EM, Van Natta M, et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2005; 41: 1313¿30. Musso G, Gambino R, Biroli G, et al. Hypoadiponectinemia predicts the severity of hepatic fibrosis and pancreatic Beta-cell dysfunction in nondiabetic nonobese patients with nonalcoholic steatohepatitis. Am J Gastroenterol 2005; 100: 2438¿46. Larson-Meyer DE, Heilbronn LK. History of non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol 2004 ; 40 : 578 ¿ 84.