B12-Riboswitch from Klebsiella pneumoniae as target for new antibiotics. Interaction study with natural and synthetic adenosylcobalamin derivatives

Resumen

Hoy dia es bien sabido que el ARN lleva a cabo más funciones que las que inicialmente se le asignaron. Los riboswitches son moléculas de ARN situadas en la región no traducida del extremo 5’ (5’-UTR). Dichas moléculas, después de interaccionar con su metabolito especifico, provocan un cambio conformacional que es el responsable final de la regulación génica y, por ello, han sido postulados como buenas dianas para antibióticos, ya que regulan rutas metabólicas essenciales. Los riboswitches contienen dos dominios, el aptamero, donde se une el metabolito y la plataforma de expression responsable de la regulación. Los mecanismos de regulación más comunes són la terminación de la transcripción y la inhibición de la traducción. Un presumible btuB riboswitch ha sido bioinformaticamente identificado en el genoma de Klebsiella pneumoniae y postulado como riboswitch de B12. En nuestro estudio, se han realizado experimentos de in-line probing para validar la secuencia como riboswitch. Un cambio conformacional del RNA ha sido detectado después de la interaccion entre el riboswitch con AdoCbl. En la conformación gen-on, la zona de unión con el ribosoma (RBS) està libre y el gen btuB puede ser expresado. En cambio, después de la interacción con el metabolito, la conformación del ARN pasa a ser gen-off en la que el RBS forma parte de una región de apareamiento de bases que impide el acceso al ribosoma. Estos echos prueban que esta sequencia es un riboswitch de B12 y sugiere un mecanismo de regulación por inhibición de la traducción. Por otra parte, los parámetros termodinámicos han sido calculados mediante valoraciones calorimétricas isotermas (ITC). Dos secuencias diferentes han sido usadas: MB01 que continene el aptamero (214 nt.) y la secuencia JP01 que contiene el aptamero y la plataforma de expresión (246 nt.) En las valoraciones calorimétricas se ha usado la AdoCbl como valorante y se han realizado diferentes medidas entre 15 °C y 30 °C para ambas secuéncias. Con los resultados obtenidos se puede decir que la interaccion entre el ARN y la AdoCbl es exotérmica y que sigue una estequiometria 1:1. La entalpía de la interacción a 25 °C es de -119±3 kJ/mol para JP01 y de -122,7±0,9 kJ/mol para MB01. Estos valores de entalpía concuerdan con el hecho de que la interacción se produce a través de la suma de interacciones débiles, como el enlace de hidrogeno o el apilamiento. Los valores de KD obtenidos para MB01 (770±90 nM a 25 °C) son siempre mayores que los de JP01 (530±50 mM a 25 °C) en todo el intervalo de temperatures. Por tanto, se puede llegar a la conclusión de que la plataforma de expressión presente en la secuencia JP01 tiene alguna función en la estabilización de la interacción del btuB riboswitc con AdoCbl. El mecanismo de regulación por inhibicion de la traducción ha sido validado acoblando el riboswitch a una proteína roja fluorescente (mCherry) y, de echo, la síntesis de la proteína fluorecente se inhibe cuando se incrementa la concentracion de cobalamina en el medio de cultivo. Recientemente, la investigación en el campo se ha centrado en la modificación de los metabólitos que regulan los riboswitches, ya que se han postulado coma posibles antibiòticos debido a la inhibición de la funcion del riboswitch. Con el propósito de sintetitzar una antivitamina de cobalamina, un cultivo de Allocromatium vinoum se ha hecho crecer en condiciones anaerobicas y de dècifit de cobalto. En estas condiciones, estas bacterias sintetizan descobaltocobalaminas y sus derivados. Después de cultivar 900 l de cultivo y recoger las pellets de las celulas, hemos sido capaces de extraer y purificar 4 mg de descobaltocobalamina y 2 mg de ácido descobaltocobírico.