Modulación de rutas de señalización, metabolismo proteico y diferenciación celular en músculo y cerebro

Resumen

La búsqueda y validación de agentes terapéuticos constituye actualmente un área emergente de investigación. Las herramientas para el desarrollo de nuevos fármacos son variadas y están basadas en la asociación de técnicas de Biología Molecular, Biología Celular, Ingeniería Genética y Señalización Celular. Así, las bases moleculares de acción de distintos agentes terapéuticos pueden ser elucidadas de una manera indiscutible. Entre las áreas de interés de la industria farmacéutica, aquellas enfermedades asociadas con el envejecimiento y deterioro en general de la población en países desarrollados ocupan una posición prioritaria. Así, patologías relacionadas con el tándem obesidad-diabetes tipo II o con el proceso de envejecimiento u otras patologías, como pérdida de masa muscular o neurodegeneración, constituyen dianas muy atractivas dada su alta prevalencia. Muchas de estas enfermedades se producen como consecuencia de la alteración en rutas de señalización intracelular. Por otro lado, si un fármaco conocido ejerce su acción activando una determinada ruta, se podría pensar en él como un buen candidato para encontrar nuevas actividades biológicas en patologías que se relacionen con una desregulación en esa ruta. En esta tesis se ha estudiado el efecto del tungstato sódico, un compuesto ya descrito por su actividad como antidiabético oral en diferentes modelos animales de diabetes (Barbera et al., 1997; Barbera et al., 1994). Su principal característica es la capacidad de activar la ruta de señalización de MAP quinasas en líneas celulares procedentes de diversos órganos y tejidos (Dominguez et al., 2003). Haciendo uso de esta propiedad hemos estudiado su efecto protector en dos patologías: atrofia muscular y neurodegeneración. La atrofia muscular se produce por una disminución en la síntesis de proteínas conjuntamente con un aumento en su degradación. La degradación de proteínas en músculo esquelético está mediada por la actividad de dos rutas conservadas: ubiquitina-proteasoma y un aumento de la autofagia lisosomal (Sandri, 2013). La primera ruta, responsable del recambio de la mayoría de proteínas musculares solubles y miofibrilares, se activa como resultado de una expresión aumentada de ubiquitina y ligasas de ubiquitina, como atrogin-1 y MuRF1 (Bodine et al., 2001). La autofagia es un mecanismo homeostático empleado por la célula para la degradación y reciclaje de orgánulos y proteínas de vida media larga y su incremento produce un desequilibrio en el recambio proteico a favor de la degradación. .En tal caso, se produce un incremento en la transcripción de una serie de genes como LC3, p62 y Bnip3 (Bonaldo and Sandri, 2013). Ambas rutas están moduladas por el factor de transcripción Forkhead box O3 (FoxO3) (Sanchez et al., 2014). FoxO3 normalmente está fosforilado por Akt y en estado inactivo en el citosol, pero en ausencia de una represión de Akt, se transloca al núcleo donde induce la expresión de una serie de genes relacionados con los dos sistemas de degradación. En cultivos de células musculares de rata L6, el tungstato sódico es capaz de promover la diferenciación de mioblastos a miotubos acelerando los cambios en los niveles de expresión de los factores de transcripción MRF (myogenic regulatory factor) y MEF2D. Además, tiene un efector positivo sobre la estabilidad de MEF2D por inhibición de la sumoilación. Por otra parte, el tungstato sódico induce la síntesis de proteínas por la activación de la ruta de señalización Ras-Raf-MAPK/ERK y su efecto positivo sobre la actividad de mTOR. Además, origina una disminución de la degradación de proteínas porque promueve la fosforilación de FoXO3a, lo que conduce a su inactivación e inhibición de su translocación al núcleo y, por tanto, a una disminución en la actividad del promotor de ubiquitina así como una menor expresión de las ligasas de ubiquitina. Asimismo, el tungstato reduce la formación de autofagosomas, la expresión de la forma lipidada de LC3, la degradación de p62 y reduce los niveles de mRNA de Bnip3 en células tratadas con dexametasona. Estos resultados obtenidos en cultivos celulares apoyan la idea de que la activación de ERK1/2 disminuye la degradación proteica a través de los dos sistemas celulares, ubiquitina-proteasoma y autofagia-lisosomal, por lo que el tungstato sódico podría ser un agente útil en situaciones fisiopatológicas en las que se presentase una atrofia muscular. Por otro lado, el desarrollo de neuritas se considera como un indicador de diferenciación celular de neuroblastos a neuronas. Cuando células Neuro2a son tratadas con tungstato sódico durante 48 horas, el porcentaje de neuroblastos que desarrollan neuritas es significativamente mayor que en las células control. A nivel molecular esto se traduce en incrementos en la expresión de la acetilcolinesterasa y de la colina O-acetiltransferasa; este último como marcador de diferenciación a neuronas de tipo colinérgico. La diferenciación inducida se produce a la par que una disminución en la proliferación celular. En neuronas, el estrés oxidativo desencadena un incremento de la autofagia y una inducción de la apoptosis (Buttke and Sandstrom, 1994; Chen et al., 2008). En células Neuro2a tratadas con peróxido de hidrógeno, el tungstato sódico es capaz de normalizar la autofagia y prevenir la apoptosis, ensayadas mediante microscopía confocal y citometría de flujo. Adicionalmente, el tungstato sódico normaliza el metabolismo proteico en células Neuro2a. La suma de los efectos positivos del tungstato sódico, tanto en diferenciación y generación de neuritas como de protección frente al estrés oxidativo hacen de este compuesto un buen candidato para ser un agente neuroprotector. Barbera, A., Fernandez-Alvarez, J., Truc, A., Gomis, R., and Guinovart, J.J. (1997). Effects of tungstate in neonatally streptozotocin-induced diabetic rats: mechanism leading to normalization of glycaemia. Diabetologia 40, 143-149. Barbera, A., Rodriguez-Gil, J.E., and Guinovart, J.J. (1994). Insulin-like actions of tungstate in diabetic rats. Normalization of hepatic glucose metabolism. The Journal of biological chemistry 269, 20047-20053. Bodine, S.C., Latres, E., Baumhueter, S., Lai, V.K., Nunez, L., Clarke, B.A., Poueymirou, W.T., Panaro, F.J., Na, E., Dharmarajan, K., et al. (2001). Identification of ubiquitin ligases required for skeletal muscle atrophy. Science 294, 1704-1708. Bonaldo, P., and Sandri, M. (2013). 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