Chiral and metabolomic strategies using micro-separative techniques coupled to mass spectrometry for the determination of compounds of pharmacological and bioanalytical interest and the search of potential biomarkers

Resumen

En esta Tesis Doctoral se han desarrollado metodologías analíticas avanzadas para la determinación enantiomérica de compuestos de interés farmacológico y bioanalítico, y estrategias metabolómicas para el estudio de sistemas biológicos y la búsqueda de potenciales biomarcadores de patologías, todo ello utilizando técnicas (micro)-separativas acopladas a la Espectrometría de Masas por su excelente selectividad y sensibilidad. El impacto que la quiralidad tiene sobre casi cualquier proceso farmacológico y biológico ha tenido en los últimos años una fuerte repercusión en muchos campos como son la industria farmacéutica y el estudio de moléculas de interés bioanalítico. Ello hace necesario disponer de nuevas metodologías analíticas sensibles y selectivas para llevar a cabo análisis quirales. En esta Tesis doctoral se ha desarrollado una metodología analítica por Electroforesis Capilar acoplada a Espectrometría de Masas que ha permitido la determinación enantiomérica del antidepresivo duloxetina con un límite de detección relativo para la impureza enantiomérica de tan solo 0.02 %. Además, se investigó la inversión observada en el orden de migración de los enantiómeros con dos selectores quirales diferentes, comportamiento que se justificó por la diferente movilidad electroforética de los complejos enantiómero-selector quiral y no por sus constantes de estabilidad aparentes. Asimismo, también utilizando la técnica de Electroforesis Capilar acoplada a Espectrometría de Masas, se desarrolló una metodología que permitió por primera vez la separación enantiomérica simultánea de los metabolitos involucrados en la ruta metabólica de la fenilalanina-tirosina mediante el empleo combinado de dos selectores quirales, obteniéndose límites de detección entre 40 y 150 nM para los compuestos estudiados. La metabolómica es una herramienta empleada en la obtención de perfiles o huellas metabólicas con objeto de encontrar diferencias entre grupos de muestras, sin conocimiento previo de en qué metabolitos se debe centrar el estudio. En la presente memoria se describe, por un lado, el desarrollo de un método de Cromatografía de Líquidos acoplada a Espectrometría de Masas, donde se comparan distintas columnas cromatográficas, empleando o no derivatización de la muestra, y distintos métodos de eliminación de proteinas de muestras de plasma, con el fin de detectar un grupo de 35 compuestos polares. La estrategia basada en la derivatización del plasma ultrafiltrado con 9-fluorenilmetiloxicarbonilo, empleando la columna C18 fue la seleccionada y se aplicó al análisis metabolómico de muestras de plasma de ratas tratadas con cocaína y alcohol tanto de forma individual como de forma combinada. El análisis multivariante permitió clasificar los distintos grupos de muestras y se identificaron algunos metabolitos responsables de dicha clasificación relacionados con el metabolismo aminoacídico. Por otro lado, se desarrolló una estrategia multiplataforma basada en Cromatografía de Líquidos con dos columnas y dos modos de ionización ortogonales y en Electroforesis Capilar, ambas técnicas acopladas a Espectrometría de Masas, para el análisis metabolómico de cantidades mínimas de muestras de tejidos. Mediante el análisis de secciones de riñón de ratón de 20 µm de grosor ha sido posible describir los distintos estadios de la enfermedad del riñón poliquístico y proponer candidatos a biomarcadores del progreso de la enfermedad.