Caracterización termodinámica y estructural de inhibidos proteicos del VIH-1 dirigidos contra GP41

Resumen

Antecedentes El SIDA o síndrome de inmunodeficiencia adquirida, ha provocado, desde su aparición, más de 70 millones de muertes en el mundo. Aún teniendo un amplio conocimiento de su agente causal, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1) en cuanto a estructura, ciclo viral y mecanismos de infección, el desarrollo de una vacuna efectiva que proteja de su infección ha resultado ser hasta la fecha inabordable. El tratamiento actual se basa en la administración de un cóctel de inhibidores cuyas dianas engloban diferentes proteínas virales involucradas en el ciclo viral, completamente necesarias para que se produzca la infección. Este tratamiento conocido como HAART, terapia antiretroviral altamente reactiva, reduce la carga viral en sangre hasta niveles indetectables, sin embargo, la interrupción de esta provoca un aumento de nuevo de dicha carga viral. Por lo que, el tratamiento se cronifica de por vida. La alta tasa de mutación del virus provoca la aparición con rapidez de cepas resistentes al tratamiento. Por ello, la producción de nuevos fármacos inhibidores sigue siendo interesante a la hora de conseguir mantener un tratamiento efectivo contra la infección. El VIH infecta principalmente linfocitos T CD4+, ya que se sirve de este receptor de las células inmunes para penetrar en su interior e infectarlas. El mecanismo propuesto para la infección se puede resumir de la siguiente manera: Las proteínas de la envoltura viral (ENV), gp120 y gp41, forman un trímero de heterodímeros, las tres subunidades de gp120 se sitúan externamente, mientras que las subunidades gp41 quedan prácticamente ocultas en el interior del complejo, ancladas a la membrana viral, (7 y 8). Las subunidades gp41 son las encargadas de promover la unión entre la partícula viral y la célula diana. La proteína gp41 consta de varios dominios: un dominio extracelular o ectodominio, formado por un péptido de fusión hidrofóbico , dos regiones helicoidales de repeticiones de 7 residuos (“heptadrepeats”) llamadas NHR y CHR, separadas por un lazo ligado por un puente disulfuro; y finalmente una región externa próxima a la membrana (MPER). El ectodominio es seguido por un dominio transmembrana y por último un dominio citoplamático C-terminal. Cuando la proteína gp120 se une al receptor CD4 y a otro correceptor del linfocito, el péptido de fusión de la gp41 se expone y penetra en la membrana de la célula inmune. Seguidamente, las subunidades de gp120 se separan y la gp41 sufre un gran cambio conformacional, pasando de un estado pre-fusión extendido, a uno post-fusión pleglado, en el que las regiones NHR y CHR forman una estructura trimérica helicolidal (“coiled coil”) muy estable, de seis hélices (9 y 10). Se cree que este cambio proporciona la energía necesaria para aproximar las membranas (11), o para que el complejo NHR-CHR intervenga en la interacción de las membranas y la mezcla de lípidos (12 y 13) conduciendo a su fusion. Una vez fusionadas las membranas se abre un poro que permite la inserción de contenido viral en la célula hospedadora. Debido a su alta conservación y a su papel clave en la infección viral, la proteína gp41 es una diana terapéutica enormemente atractiva para el diseño de vacunas y nuevos fármacos. Actualmente se acepta que, durante la infección, en el estado de prefusión, las regiones NHR y CHR se exponen de manera transitoria. Este hecho ha impulsado la generación de fármacos que interaccionen con una de las dos regiones bloqueando la interacción entre NHR y CHR impidiendo la fusión de la partícula viral (14 y 15). El único fármaco aprobado para su uso terapéutico contra el VIH que actúa mediante este mecanismo de inhibición es el T20, también conocido como enfurvitide, o con su nombre comercial, Fuzeon . El T20 es un péptido mimético de la región CHR de 36 aminoácidos, que interaccióna con la NHR impidiendo la fusión. Su uso es muy restringido, y solo se utiliza cuando la HAART no funciona, ya que es un fármaco costoso, además de necesitar grandes dosis, 90mg/dosis, lo que conlleva a la mayor probabilidad de generar resistencias (16). Posteriormente se han diseñado otros inhibidores de fusión derivados del T20 mediante modificación de su secuencia para mejorar la afinidad y reducir la aparición de resistencias, aunque ninguno ha llegado a aprobarse como fármaco. Una estrategia alternativa para el desarrollo de inhibidores consiste en mimetizar la región NHR de gp41 mediante diferentes diseños que tratan de reproducir su conformación en manojo de trés hélices NHR que está presente en el estado pre-fusión de gp41, Aunque existen varias familias de inhibidores de este tipo, ninguno de ellos ha alcanzado un grado de desarrollo avanzado debido a su baja estabilidad y solubilidad, así como a la mayor dificultad de producción que implica su mayor tamaño molecular (17). El grupo de investigación donde se realiza esta tesis doctoral ya ha trabajado anteriormente en el marco de un proyecto europeo previo, en el diseño y desarrollo de vacunas e inhibidores contra el VIH. Durante este proyecto se diseñaron nuevas proteínas miméticas de la región NHR, que interaccionan ávidamente con la región CHR e inhiben la infección por VIH en ensayos estandarizados in vitro. De estas proteínas, cov-NHR, cov-NHRABC es una de las más prometedoras candidatas para el desarrollo de un nuevo inhibidor del VIH (18). Las proteínas covNHR mimetizan la estructura trimérica del NHR, aunque utilizando una sola cadena polipeptídica. Con este diseño novedoso se mejora el rendimiento de producción que puede realizarse mediente expresión en E. coli, aumenta la estabilidad y la solubilidad de estas moléculas, en comparación con péptidos NHR triméricos unidos covalentemente u otros diseños. Los objetivos principales de esta tesis son definir el mecanismo molecular de inhibición del VIH por las proteínas covNHR, comprender las bases químico-físicas y estructurales de dicha inhibición, estudiar su estabilidad, solubilidad, facilidad de producción y función inhibidora. Desarrollo teórico Para la producción de las proteínas se usó tecnología recombinante en cepas de E.coli adaptadas para la producción de proteínas recombinantes. La purificación de las proteínas se realizó mediante el uso de cromatografías de afinidad, utilizando propiedades de las proteínas, como la extensión de Histidinas añadida a la secuencia de aminoácidos de las proteínas y el punto isoeléctrico de ellas. La caracterización biofísica se llevó a cabo utilizando técnicas como el dicroísmo circular, que permite la caracterización de la estructura de las proteínas. La dispersión dinámica de luz, que permite conocer el tamaño molecular de las proteínas y si presentan estados de agregación. Y la calorimetría diferencial de barrido, que permite obtener los parámetros termodinámicos de desplegamiento, en los que se incluyen la temperatura de desplegamiento, que proporciona información sobre la estabilidad térmica de las proteínas. Para la caracterización termodinámica con las secuencias diana de los constructos covNHR, se utilizó la calorimetría isotérmica de titulación, cuya información nos revela la afinidad de la interacción NHR-CHR, así como los parámetros termodinámicos de unión, como la entalpía, la entropía y la energía libre del proceso. Por último, para la caracterización funcional se realizaron experimentos de unión de las proteínas a estructuras ENV nativas, así como experimentos de inhibición frente a una clasificación de pseudovirus de VIH-1, que engloban una amplia variedad de cepas del virus. Conclusión Este estudio nos ha permitido el desarrollo de seis variantes de proteínas covNHR, cuya alta estabilidad y gran precisión a la hora de mimetizar la superficie de interacción con CHR ha sido de gran ayuda para el estudio de los mecanismos de inhibición que se llevan a cabo durante la fusión del virus y la célula. Así como, para la obtención de una molécula con una capacidad de inhibición comparable al fármaco Fuzeon o enfuvirtide, para un amplio abanico de cepas de VIH-1 Referencias bibliográficas 1. Tseng, A., and M. Foisy. 2012. Important Drug-Drug Interactions in HIV-Infected Persons on Antiretroviral Therapy: An Update on New Interactions Between HIV and Non-HIV Drugs. Curr Infect Dis Rep 14:67-82. 2. Johnson, V. A., V. Calvez, H. F. Gunthard, R. Paredes, D. Pillay, R. Shafer, A. M. Wensing, and D. D. Richman. 2011. 2011 update of the drug resistance mutations in HIV-1. Top Antivir Med 19:156-164. 3. Duerr, A., Y. Huang, S. Buchbinder, R. W. Coombs, J. Sanchez, C. del Rio, M. Casapia, S. Santiago, P. Gilbert, L. Corey, and M. N. Robertson. 2012. Extended follow-up confirms early vaccine-enhanced risk of HIV acquisition and demonstrates waning effect over time among participants in a randomized trial of recombinant adenovirus HIV vaccine (Step Study). J Infect Dis 206:258-266. 4.Haynes, B. 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