Mecanismos moleculares y efecto modulador del hidroxitirosol en la terapia antitumoral del cáncer de mama

  1. Pulido Morán, Mario
Supervised by:
  1. María del Carmen Ramírez Tortosa Director
  2. César Luis Ramírez Tortosa Director
  3. José Luis Quiles Morales Director

Defence university: Universidad de Granada

Fecha de defensa: 29 April 2016

Committee:
  1. María José Faus Dáder Chair
  2. Javier Díaz Castro Secretary
  3. Ricardo Enrique Perez Tomas Committee member
  4. Rosa Sánchez Álvarez Committee member
  5. José Juan Gaforio Martínez Committee member
Department:
  1. BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR II

Type: Thesis

Abstract

INTRODUCCIÓN El cáncer de mama puede definirse como una proliferación acelerada e incontrolada de células del epitelio glandular, aumentado su capacidad reproductiva. Su clasificación puede variar en función del origen del mismo, de la localización, de la invasividad que presente, grado de diferenciación, estadificación o en función de las distintas proteínas que expresen en la superficie de sus células y su respuesta hormonal. Hoy en día, el cáncer de mama presenta una incidencia y mortalidad crecientes, de tal forma que se ha convertido en la causa de muerte asociada a tumores más frecuente en mujeres. De la misma forma, a nivel mundial es una de las 10 causas más frecuentes de muerte en mujeres mayores de 60 años. En España, la Red Española de Registros del Cáncer estimó para 2014 un total de 26354 casos nuevos de cáncer de mama, produciéndose un incremento sustancial respecto a años anteriores. En España, la mortalidad en este tipo de tumores no es tan elevada respecto a la gran incidencia que presenta, principalmente debido a los programas de cribado y protocolos de prevención llevados a cabo en los últimos años. Comparados con otros países europeos, España se sitúa a la cola en incidencia y mortalidad. Este hecho tan llamativo ha sido objeto de múltiples estudios, que finalmente han comprobado un efecto de distintos elementos de la dieta sobre esta y otras patologías, como por ejemplo el Hidroxitirosol: Un fenol presente en el aceite de oliva virgen extra. Existe un modelo carcinogénico establecido en tres fases: Iniciación, promoción y progresión. Estas tres fases se han relacionado con un desequilibrio redox que promueve la actuación de las denominadas especies reactivas de oxígeno y radicales libres sobre las células, incidiendo sobre procesos de apoptosis, proliferación y control de los mismos, así como los distintos sistemas de reparación y compensación de este desequilibrio. Una de las características principales de los quimioterápicos más empleados en el tratamiento del cáncer de mama, es que cursan, en la mayoría de los casos, bien produciendo por sí mismos distintas especies reactivas de oxígeno como mecanismo de acción, o bien desencadenando de forma indirecta un desequilibrio del estado redox que derive finalmente en una incapacidad de compensación de moléculas prooxidantes por parte del organismo, virando finalmente hacia un estrés oxidativo que desencadena múltiples efectos adversos sobre las pacientes y sobre su recuperación. El Hidroxitirosol se caracteriza por estar presente, entre otros lugares, en el aceite de oliva virgen extra, un alimento altamente consumido en la cuenca mediterránea y entre estos países, España. Este compuesto ha demostrado ampliamente en la literatura un carácter antioxidante, que le ha servido para obtener el reconocimiento de la Agencia Europea de Seguridad Alimentaria como compuesto cardioprotector a dosis entre 2 y 15 mg diarios, debido a su capacidad de impedir la oxidación de lipoproteínas LDL. Además, múltiples estudios han establecido una potente actividad antitumoral, principalmente sobre células tumorales sensibles a hormonas, aunque también sobre animales de experimentación con receptores hormonales positivos, donde demostró una capacidad antitumoral equiparable a otros fármacos del grupo de antraciclinas, ampliamente utilizados en el tratamiento convencional del cáncer de mama. OBJETIVOS El objetivo principal de este estudio fue conocer si el Hidroxitirosol ejercía algún efecto quimiomodulador de la terapia antitumoral basada en epirrubicina y ciclofosfamida, seguida de taxanos, y si el Hidroxitirosol presentaba la capacidad de mejorar la respuesta antitumoral general de las pacientes, disminuyendo el estrés oxidativo asociado a la propia patología y al tratamiento antineoplásico. Como consecuencia del complejo diseño del ensayo clínico llevado a cabo, este objetivo principal se complementó a través de una serie objetivos secundarios:  Establecer un posible mecanismo de acción llevado a cabo por el Hidroxitirosol a nivel sistémico. Para ello, se determinaron distintas variables de estrés oxidativo plasmático que valorasen las alteraciones de oxidación de macromoléculas como proteínas, lípidos, hidratos de carbono o ácidos nucleicos.  Conocer si el Hidroxitirosol alteraba parámetros histopatológicos y bioquímicos que evaluasen la respuesta antitumoral de las pacientes y la funcionabilidad renal, hepática y cardiaca, respectivamente.  Establecer si el Hidroxitirosol modulaba la expresión de proteínas relacionadas con rutas de proliferación y apoptosis celular, como la proteína Secreted Frizzled-Related Protein 4.  Describir nuevas alteraciones que no han sido previamente expuestas en la literatura científica, como modificaciones bioquímicas, clínicas, moleculares y patológicas asociadas al tratamiento combinado de epirrubicina y ciclofosfamida, seguido de taxanos, utilizado en el ensayo clínico como quimioterapia neoadyuvante. MATERIAL Y MÉTODOS Se llevó a cabo un ensayo clínico aleatorizado con grupos paralelos (tratado con Hidroxitirosol y placebo) a triple ciego. El criterio de inclusión del ensayo fue diagnóstico de cáncer de mama con expresión de receptores hormonales (receptores de estrógenos y/o receptores de progesterona), sin amplificación del gen HER-2 (fenotipos Luminal A y B) que recibían tratamiento quimioterápico antes de la cirugía según las recomendaciones definidas en la guía de Práctica Clínica elaborada por el Subcomité Multidisciplinario de Mama del Complejo Hospitalario de Jaén. Con estas mujeres se establecieron dos grupos: el intervenido al que se le administró una suplementación dietética con HT a una dosis única de 15 mg/día en forma de cápsulas duras y el grupo control con suplementación dietética de placebo administrado en una única dosis diaria en forma de cápsulas duras, tras la firma del consentimiento informado. Cada grupo (Hidroxitirosol o placebo) participante en estudio (T1-basal) se sometió a una quimioterapia neoadyuvante consistente en epirrubicina y ciclofosfamida (T2-final tratamiento), seguida de taxanos (T3-final de terapia), constituyendo los tres puntos temporales de nuestro estudio. Finalmente, el último punto temporal del estudio fue transcurrido un mes desde la intervención quirúrgica de la terapia neoadyuvante (T6), tras la valoración del estado de salud de las pacientes participantes el día de la cirugía (T4) y a la semana de la intervención quirúrgica (T5). Estos dos puntos temporales (T4 y T5) no se contemplaron para esta tesis doctoral. En cada punto, se tomaron muestras de sangre, de las que se obtuvo suero, plasma y linfocitos aislados. Con estas muestras, se determinaron distintas variables de daño oxidativo a proteínas, lípidos, hidratos de carbono y ácidos nucleicos, así como el balance del sistema antioxidante y variables bioquímicas e histopatológicas (del tumor pre y post cirugía). Los datos recogidos sobre las variables dependientes e independientes en este estudio se registraron en una base de datos anonimizada, construida para tal fin y procesadas estadísticamente mediante el programa estadístico SPSS v21. En primer lugar se realizó un análisis estadístico descriptivo de cada una de las variables de la base de datos. Para ello en el caso de las variables cualitativas se obtuvo una tabla de frecuencias (número de casos y porcentaje) y como representación gráfica el grafico de sectores. Para el caso de las variables cuantitativas se obtuvo para cada una de ellas: media, mediana, desviación típica, mínimo y máximo y como representación gráfica el histograma. Para determinar si existían diferencias en los marcadores a lo largo del tiempo y entre los dos grupos de tratamiento se calculó el Modelo lineal General de Medidas Repetidas teniendo en cuenta el factor intra-sujetos el tiempo y como factor inter-sujetos el Grupo de tratamiento. Para aplicar los test se ha asumió la normalidad de los datos, a pesar del escaso tamaño de muestra. En cada test se estudió la esfericidad de la matriz de varianzas-covarianzas y se tuvo en cuenta los resultados de los test correspondientes, según esta comprobación. Para todos los análisis se consideró significativo un valor α=0.05. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La gran mayoría de los resultados, sólo obtuvieron diferencias significativas a lo largo del tiempo y pocas diferencias por grupo o en la interacción tiempo x grupo (tratado o no con Hidroxitirosol), lo que hizo postular un nuevo enfoque del estudio, contemplándose un único grupo, independientemente de que estuviesen tratados o no con Hidroxitirosol. Este nuevo enfoque trataba de establecer cómo distintas variables asociadas al estrés oxidativo en pacientes con cáncer de mama se modificaban a lo largo del tiempo tras el tratamiento con epirrubicina y ciclofosfamida, seguido de taxanos, en una terapia neoadyuvante. En la valoración del daño oxidativo a lípidos e hidratos de carbono, se obtuvieron diferencias exclusivamente asociadas al tratamiento quimioterápico en la concentración de isoprostanos y lípidos totales plasmáticos. Igualmente, se detectaron diferencias significativas entre el estado inicial y final de las pacientes (asociadas a la terapia antitumoral completa) en los valores de ácidos grasos no esterificados y Productos Finales de Glicosilación Avanzada. Dentro de las variables determinadas para cuantificar el daño oxidativo a proteínas, se encontraron diferencias significativas en los niveles de los productos finales de oxidación proteica como consecuencia de la terapia antitumoral completa, sin diferencias significativas asociadas a los quimioterápicos de forma aislada. En referencia al daño oxidativo asociado a ácidos nucleicos, a pesar de que no se hallaron diferencias en el daño oxidativo en el ADN de linfocitos aislados, sí se detectó un incremento en los valores plasmáticos de 8-hidroxi-2-deoxiguanosina como consecuencia de la terapia antitumoral neoadyuvante en su conjunto, sin detectarse diferencias asociadas a un fármaco o grupo de fármacos concreto. La evaluación del sistema de defensa antioxidante durante el tratamiento quimioterápico concluyó con resultados significativos en la capacidad antioxidante total del plasma y en la concentración de vitamina E, presentando comportamientos opuestos a lo largo del tratamiento con los distintos fármacos. Así mismo, tras la valoración de la terapia antitumoral completa (desde el inicio hasta un mes tras la intervención quirúrgica), se observaron diferencias significativas en cuanto a la actividad de superóxido dismutasa y catalasa, con un descenso en la actividad de ambas enzimas. Los valores de concentración plasmática de la proteína Secreted Frizzled-Related-Protein 4 se vieron estadísticamente modificados sólo tras el tratamiento quimioterápico con epirrubicina y ciclofosfamida, que inducía su expresión. Los taxanos disminuyeron la concentración de esta proteína sin lograr que alcanzara los niveles basales, manteniéndola en una concentración plasmática elevada. Se interpretó como un factor positivo el hecho de que los quimioterápicos fuesen capaces de elevar una proteína capaz de actuar inhibiendo los receptores Frizzled y la ruta Wnt, relacionados con la carcinogénesis en varios tipos de tumores. En referencia a las variables bioquímicas determinadas, pese a haberse obtenido diferencias estadísticamente significativas, no todas las variables proporcionan información clínicamente relevante respecto a las alteraciones que sufren las pacientes a lo largo del tratamiento, pues en la mayoría de los casos, aunque las variables se vieron modificadas, no se situaron fuera de los rangos reconocidos como clínicamente patológicos, considerándose como valores normales de referencia para individuos sanos. Las principales alteraciones clínicamente importantes se hallaron a nivel de proteínas marcadoras de daño hepático como Lactato deshidrogenasa o Transaminasa glutámico pirúvica y a nivel de alteraciones del perfil lipídico como en lipoproteínas de alta y baja densidad, o colesterol total. CONCLUSIONES 1. A través de este estudio, se comprueba por primera vez en humanos que, en el tratamiento neoadyuvante frente al cáncer de mama, el Hidroxitirosol no ejerce efectos clínicamente relevantes durante la quimioterapia basada en epirrubicina y ciclofosfamida, seguida de taxanos, ni tampoco a lo largo del tratamiento antitumoral completo. La terapia antitumoral en sí misma no produce alteraciones daño oxidativo a ácidos nucleicos, por lo que el Hidroxitirosol no ejerce ningún efecto beneficioso sobre el daño oxidativo en ADN de linfocitos aislados. Así mismo, el Hidroxitirosol no interfiere en el metabolismo de las purinas ni del colesterol y no modifica significativamente los electrolitos plasmáticos ni las enzimas asociadas al daño hepático y muscular. 2. Una terapia combinada con ciclofosfamida y epirrubicina puede inducir un mecanismo de respuesta del sistema antioxidante plasmático de forma tiempo dependiente, con el objetivo de contrarrestar el efecto prooxidante que generan este grupo de fármacos. Este mecanismo de compensación, es el causante indirecto de una disminución de los niveles de isoprostanos plasmáticos durante la quimioterapia neoadyuvante. 3. La terapia antitumoral neoadyuvante altera el sistema de defensa antioxidante a distintos niveles: disminuye el contenido de vitamina E y la actividad superóxido dismutasa y catalasa en plasma. 4. Los niveles de ácidos grasos no esterificados y los productos finales de glicosilación avanzada tienen una relación directa con el cáncer de mama. Sin embargo, los productos finales de oxidación proteica y 8-hidroxi-2-deoxiguanosina, mantienen una relación inversa con el cáncer de mama y con el progreso de la terapia antitumoral neoadyuvante, aumentando a medida que se erradica el tumor. 5. Este estudio describe por primera vez en pacientes con cáncer de mama que la quimioterapia neoadyuvante empleada promueve un aumento en los niveles plasmáticos de la proteína Secreted Frizzled-Related Protein 4, asociada con un descenso en la proliferación de células tumorales y un incremento en su apoptosis. 6. La terapia antitumoral neoadyuvante no produce alteraciones plasmáticas clínicamente relevantes en los parámetros bioquímicos generales ni en los relacionados con la funcionalidad renal y hepática. Sin embargo, en lo referente al perfil lipídico, la terapia antitumoral altera el metabolismo del colesterol, siendo importante su valoración y normalización con el objetivo de disminuir alteraciones metabólicas severas y recidivas.