Estrés oxidativo y muerte celular en la retina neural y en otros sistemas. Implicación de la enzima Poli(ADP-ribosa) Polimerasa-1 (PARP-1)

Resumen

Nuestro organismo se encuentra expuesto constantemente a diversos agentes genotóxicos, tanto de origen externo como interno. Uno de estos agentes, las especies reactivas de oxígeno (ROS) originadas principalmente a causa del metabolismo oxidativo, pueden inducir importantes daños en el ADN. Si la presencia de ROS se mantiene de forma prolongada, o estos radicales no son neutralizados por los sistemas de defensa antioxidante, puede derivar en una situación conocida como estrés oxidativo, nociva para la célula. El enzima Poli(ADP-ribosa) Polimerasa 1 (PARP-1) es crucial para la detección y posterior reparación del daño oxidativo en el ADN generado por la acción de las ROS. Para ello, PARP-1 modifica y activa una serie de proteínas nucleares involucradas en los mecanismos de reparación del ADN a las que añade un polímero de ADP-ribosa en un proceso conocido como poli-ADP-ribosilación. En determinadas circunstancias, sin embargo, PARP-1 puede desencadenar procesos de muerte celular, bien por el agotamiento energético causado por el consumo excesivo del NAD+, sustrato de PARP-1, o bien por la inducción de la traslocación del Factor Inductor de Apoptosis (AIF) desde la mitocondria al núcleo. En la presente Tesis doctoral se ha estudiado el papel de la enzima PARP-1 en la respuesta al daño oxidativo inducido por las ROS, tanto en un modelo murino como humano. Como modelo murino se ha utilizado la retina de ratón, estructura nerviosa que consume grandes cantidades de oxígeno durante el proceso de fototransducción; en concreto, se han usado retinas postnatales en desarrollo, cultivos organotípicos de retina y una línea celular derivada de fotorreceptores. Por otro lado, se ha utilizado también una línea celular de hepatocitos humanos, dado que el hígado es un órgano sometido a un alto consumo de oxígeno durante el proceso de detoxificación. Ambos modelos han sido utilizados como ejemplos de estructuras sometidas a una alta presencia de ROS in vivo, y en los que el estrés oxidativo parece tener un papel importante en el desarrollo de ciertas patologías asociadas con estos órganos. En primer lugar, esta Tesis muestra que el daño oxidativo se incrementa progresivamente durante el desarrollo postnatal de la retina de ratón: es bajo durante las primeras semanas de desarrollo, pero aumenta a partir del día 14 de desarrollo postnatal (P14). Al mismo tiempo, la actividad de PARP-1 resultó ser elevada durante la primera semana de desarrollo postnatal (desde P0 a P7), para disminuir rápidamente en estadios posteriores. Curiosamente, los niveles reducidos de daño oxidativo en la retina durante la primera semana de desarrollo postnatal coinciden con un periodo de actividad de PARP-1 elevada. La expresión de la forma fosforilada de la histona H2AX (γ-H2AX) es considerada como un marcador de daño de doble cadena en el ADN; la presencia de γ-H2AX se incrementa durante la segunda semana de desarrollo postnatal, con un pico de mayor expresión en P14, cuando la actividad de PARP-1 era más baja. Por tanto, los datos anteriores sugieren que PARP-1 juega un papel en el control del daño en el ADN durante las etapas tempranas del desarrollo postnatal de la retina. En segundo lugar, para evaluar el papel de PARP-1 en la respuesta al daño oxidativo inducido sobre la retina de ratón se sometieron cultivos organotípicos de explantes de retina de ratón y la línea celular murina 661W (modelo in vitro de fotorreceptores de ratón) a un tratamiento con peróxido de hidrógeno (H2O2), agente generador de daños oxidativos. La inhibición farmacológica de PARP-1 con el inhibidor PJ34 en explantes de retina tratados con H2O2 incrementó la cantidad de células en proceso de muerte; al mismo tiempo se observaba un aumento de γ-H2AX, más notorio en la capa nuclear externa, donde se localizan los núcleos de los fotorreceptores. El análisis de fosfoproteómica realizado sobre la línea celular 661W tras el tratamiento oxidativo mostró que la inhibición de PARP-1 potenció la fosforilación, y consiguiente activación, de proteínas relacionadas con la respuesta al daño en el ADN, concretamente en motivos SQ. La fosforilación en motivos SQ se ha relacionado con la activación de las quinasas ATM/ATR, implicadas en la respuesta celular al daño en el ADN. Además, la inhibición de PARP-1 tras el tratamiento oxidativo redujo la proliferación de la línea celular retiniana y potenció la parada del ciclo celular en fase G2/M. Finalmente, la inhibición de PARP-1 potenciaba la fosforilación de los sustratos de ATM/ATR tras el tratamiento oxidativo, tanto en explantes de retina como en la línea celular 661W, lo que indicaba un incremento de la actividad de estas quinasas. Estos resultados indican que la inhibición de PARP-1 potencia los efectos adversos inducidos por el tratamiento oxidativo en la retina de ratón, especialmente sobre las células de los fotorreceptores. En tercer lugar, se estudió el papel de PARP-1 en las células hepáticas sometidas a estrés oxidativo ya que el hígado es otro órgano susceptible de ser dañado por la acción de las ROS, y además el estrés oxidativo parece estar involucrado en la progresión de diversas enfermedades hepáticas. Para evaluar el papel de PARP-1 y su relación con la respuesta al daño oxidativo en el hígado se utilizó la línea celular hepática humana WRL68 (modelo in vitro de hepatocitos), que fue también tratada con H2O2. Dicho tratamiento produjo un descenso de la viabilidad celular e incrementó la actividad de PARP-1 de manera dosis dependiente. En cambio, la inhibición de la actividad de PARP-1 mediante los inhibidores PJ34 y AG14361 incrementó la viabilidad en estas células y redujo la muerte tras el tratamiento oxidativo. Además, la inhibición de PARP-1 contrarrestó los cambios observados en la morfología mitocondrial tras el tratamiento oxidativo: redujo el número de mitocondrias globulares (asociadas a procesos de fragmentación mitocondrial), incrementó el número de mitocondrias con morfología tubular, así como su área y el número de crestas. La administración de NAD+ también incrementó la viabilidad celular y mostró el mismo efecto que los inhibidores de PARP-1 en cuanto a la preservación de la morfología mitocondrial tras el tratamiento oxidativo. Por último, la activación de PARP-1 tras el tratamiento con H2O2 produjo un agotamiento en los niveles de ATP, situación que fue revertida en presencia de los inhibidores de PARP-1 o mediante la administración de NAD+. Todo lo anterior indica que la inhibición de PARP-1, gracias en parte a la preservación del sustrato NAD+, tiene un papel protector en las células hepáticas sometidas a estrés oxidativo, ya que incrementa la viabilidad celular, preserva los niveles de ATP intracelulares, reduce la fragmentación mitocondrial y disminuye la muerte celular. Por último, y en cuarto lugar, el análisis de fosfoproteómica realizado en la línea celular hepática mostró que el bloqueo de la actividad de PARP-1, bien mediante el uso del inhibidor PJ34 o mediante el silenciamiento de PARP-1, era capaz de contrarrestar parte de los cambios observados en la fosforilación de las proteínas tras el tratamiento oxidativo. Además, la administración de NAD+ mostró efectos similares al producido por el inhibidor PJ34 o por el silenciamiento de PARP-1. En concreto, los ensayos de fosfoproteómica revelaron que la quinasa AMPK (proteína quinasa activada por AMP), implicada en la respuesta celular inducida por un estrés energético, presenta mayor activación tras el tratamiento con H2O2, tal vez en respuesta al descenso de los niveles de ATP como consecuencia de la sobreactivación de PARP-1 tras el tratamiento oxidativo. Sin embargo, el silenciamiento de PARP-1 redujo la actividad de AMPK y disminuyó el estado de fosforilación de ciertos sustratos de AMPK, como el enzima Acetil-CoA carboxilasa 1 (ACC1) o la proteína activadora de GTPasas TBC1D1. La administración de NAD+ en las células sometidas a tratamiento oxidativo mostró resultados análogos, indicando que el agotamiento energético causado por la sobreactivación de PARP-1 podría ser responsable de los cambios observados en el patrón de fosforilación y en la actividad de AMPK. Por último, el silenciamiento de PARP-1 también incrementó la viabilidad celular de la línea celular WRL68 tras el tratamiento oxidativo. En resumen, en esta Tesis doctoral se muestra que la inhibición del enzima PARP-1 puede tener un efecto diferente dependiendo del tipo de célula afectada por el estrés oxidativo; la inhibición de PARP-1 podría tener un efecto negativo en el tratamiento de enfermedades retinianas en las que el estrés oxidativo esté involucrado, mientras que la inhibición de PARP-1 puede ser una posible diana terapéutica para el tratamiento de enfermedades hepáticas asociadas con el estrés oxidativo.