A coordinated pathway for nitrate assimilation and nitric oxide detoxification in Bradyrhizobium diazoefficiens

Resumen

El nitrógeno (N) es uno de los componentes esenciales para la vida, con una gran demanda para los seres vivos. Frecuentemente es el factor limitante para el crecimiento de muchos organismos, ya que, aunque constituye el 78% de la composición del aire (N2), solamente una pequeña proporción de los organismos, los diazótrofos, son capaces de fijarlo (Martinez-Espinosa et al., 2011). Sin embargo, la mayoría de los organismos utilizan compuestos nitrogenados disponibles en el medio ambiente, presentes como una amplia variedad de moléculas que contienen nitrógeno en diferentes estados de oxidación, y que conforman el ciclo del nitrógeno siendo la más abundante el nitrato (NO3-). La asimilación de NO3- es un proceso ubicuo realizado por procariotas, hongos, algas y plantas superiores, clave para movilizar este compuesto, cuya acumulación provoca problemas medio ambientales y de salud pública (Guerrero et al., 1981). Bioquímicamente, la reducción asimilativa del NO3- siempre tiene lugar por una enzima nitrato reductasa con un centro activo de molibdeno, donde el NO3- es reducido a nitrito (NO2-). A continuación, el NO2- es reducido hasta amonio (NH4+) por una enzima nitrito reductasa con un grupo sirohemo en su centro activo. Finalmente, el NH4+ es incorporado en esqueletos carbonados para su utilización en el metabolismo celular (Moreno-Vivián et al., 2011). El NO3-, además puede ser utilizado por microorganismos como aceptor final de electrones en cadenas respiratorias, siendo la más importante la desnitrificación, proceso en el cual el NO3- es reducido hasta N2 con los intermediarios NO2-, óxido nítrico (NO) y óxido nitroso (N2O), los dos primeros, NO2- y fundamentalmente el NO, tóxicos para las células (Stern & Zhu, 2014). Bradyrhizobium diazoefficiens es una α-proteobacteria, diazótrofo del orden Rhizobiales, capaz de crecer con NO3- como única fuente de nitrógeno, tanto para asimilarlo, como aceptor final de electrones, para respirarlo, mediante la desnitrificación. B. diazoefficiens es conocido principalmente, por asociarse simbióticamente con plantas de soja (Glycine max). La asociación simbiótica entre la planta y B. diazoefficiens, se establece en unas estructuras especializadas de la raíz de la planta, llamadas nódulo, donde tiene lugar la fijación biológica del N2, y en el caso particular de B. diazoefficiens, también la desnitrificación (Bedmar et al., 2013). Estudios previos realizados por el Grupo del Metabolismo del Nitrógeno del Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos de la Estación Experimental del Zaidín (CSIC-Granada) habían demostrado que la hipoxia y el NO3- inducen la formación de NO en los nódulos de soja (Sanchez et al., 2010). Debido al efecto inhibidor del NO sobre la actividad nitrogenasa, era de esperar la presencia de mecanismos que lo eliminaran dentro del nódulo. Estudios realizados por Meakin y colaboradores (2006) sugerían la existencia en los nódulos de sistemas para la destoxificación de NO adicionales a la propia enzima NO reductasa de la ruta de la desnitrificación. En el genoma de B. diazoefficiens, localizamos la presencia de una hemoglobina, Bjgb, codificada por el gen blr2807 (bjgb), que posee alta homología con las hemoglobinas de dominio único Vgb y Cgb de Vitreoscilla stercoraria y Campylobacter jejuni, cuyo papel en destoxificación de NO estaba ya demostrado (Sánchez et al., 2011). Junto al gen bjgb responsable de la síntesis de Bjgb, se encuentran otros genes responsables de la síntesis de proteínas potencialmente implicadas en la asimilación de nitrato, tales como blr2803-05 (nrtABC) que codifican un transportador de nitrato tipo ABC; blr2806 (narK), responsable de una proteína implicada en el transporte de NO3-/NO2-; blr2808 (flp), que codifica una flavoproteína; y blr2809 (nasC) implicada en la síntesis de la nitrato reductasa asimilativa. Por otra parte, distalmente, se encuentran genes también implicados en asimilación de NO3-, bll4571 (nirA), que codifica la nitrito reductasa asimilativa; y bll4572-73 (nasST), responsables de la síntesis de un regulador de respuesta a NO3-/NO2-. Mediante diferentes aproximaciones experimentales, en esta Tesis Doctoral hemos podido demostrar la implicación de los genes blr2806-blr2809 y bll4572-73 en la asimilación de NO3- y NO2- de B. diazoefficiens. Así como, la función de Bjgb, como mecanismo para la eliminación del NO generado por NasC durante la asimilación de NO3-, lo que hace a este grupo de genes un sistema coordinado para la asimilación de NO3- y NO2- y destoxificación de NO, descrito por primera vez en bacterias. Adicionalmente, hemos caracterizado los elementos más importantes de la regulación de estos genes, e identificado los reguladores que intervienen en la expresión de los mismos. En esta Tesis Doctoral, se ha llevado a cabo la construcción de cepas de B. diazoefficiens mutantes en fase por deleción, en cada uno de los genes blr2803-blr2809 y bll4572-73 El análisis fenotípico de las mutantes, ha permitido demostrar que NasC y NirA son las subunidades catalíticas para la reducción asimilativa de NO3- y NO2-, respectivamente. Ambas cepas mutantes para nasC y nirA, son incapaces de crecer con NO3- como única fuente de nitrógeno. En el caso de la mutante nirA, tampoco fue capaz de crecer con NO2- y lo acumuló en presencia de NO3- en el medio, lo que indica que la asimilación de NO3- queda bloqueada a nivel de la reducción de NO2-. Esta hipótesis, fue confirmada al cuantificar la actividad NO3- y NO2- reductasa de ambas mutantes, mientras que la mutante nasC carece de actividad NO3- reductasa, pero mantiene la NO2- reductasa, ocurre lo contrario en la cepa mutante nirA. Además de NasC y NirA, en esta Tesis se ha demostrado la implicación de la flavoproteína (Flp) en la asimilación de NO3-, puesto que una cepa mutante flp fue incapaz de crecer únicamente con esta fuente de nitrógeno, sin embargo, no interviene en el mecanismo catalítico, sino en la transferencia electrónica a NasC, debido a que esta cepa no pierde la actividad NO3- reductasa cuando se usa un donador artificial de electrones. La implicación de la hemoglobina de dominio único Bjgb en destoxificación de NO, se ha demostrado al verificar que la cepa mutante en este gen presenta un déficit de crecimiento en anaerobiosis con NO3-. Además, en presencia de un agente donador de NO, la cepa mutante bjgb mostró un retraso en su crecimiento, al igual que una mutante en flp, lo que indica que posiblemente los electrones que necesita Bjgb para eliminar el NO se los proporciona Flp. Adicionalmente, en una mutante bjgb, la expresión del promotor del gen norC, dependiente de NO, se induce, indicando un aumento de la concentración de NO en esta cepa, lo cual se ha verificado al observar un aumento en la capacidad de consumir NO y de producir N2O en la cepa mutante bjgb. NarK, posiblemente actúa como un nivel adicional de control para la eliminación de NO2- intracelular, que puede conducir a la producción de NO, sin embargo, bajo nuestras condiciones experimentales, la eliminación de NO2- del interior de la célula que realiza NarK, provoca una limitación en el crecimiento con NO3- o NO2- como únicas fuentes de nitrógeno. A nivel genético, hemos verificado que los genes narK-bjgb-flp-nasC se transcriben como una unidad policistrónica bajo el control de un promotor situado en narK, con un inicio de la transcripción identificado por 5’-RACE, y que nirA está controlado por un promotor situado en el espacio intergénico previo a éste. En la región promotora de narK se ha identificado una secuencia consenso o caja FNR, además de cajas NtrC o la formación de horquillas con las secuencias ANTAR en el inicio de sus ARN mensajeros que se han localizado tanto en la región promotora de narK como de nirA. La funcionalidad de estos elementos reguladores se ha confirmado mediante el empleo de cepas de B. diazoefficiens mutantes en el gen ntrC, que es responsable de la síntesis del regulador transcripcional NtrC implicado en la regulación general por compuestos nitrogenados. Una cepa mutante en el gen ntrC es incapaz de crecer con NO3- como única fuente de nitrógeno, y presenta un considerable defecto en el crecimiento con NO2-, careciendo esta cepa de las actividades NO3- y NO2- reductasas, así como mostrando bajos niveles de expresión de las fusiones transcripcionales narK-lacZ y nirA-lacZ. De forma similar, la cepa mutante del regulador de respuesta a NO3-/NO2- NasT, es incapaz de crecer con NO3- y NO2-, y mostró valores reducidos de actividades nitrato y nitrito reductasa, así como de expresión narK-lacZ y nirA-lacZ comparados con los niveles observados en la cepa parental. Estos resultados confirman la implicación de las horquillas presentes en el ARN mensajero de las regiones promotoras de los genes narK y nirA en la terminación prematura de la transcripción en ausencia de la proteína NasT. Por último, se ha verificado la dependencia de los promotores narK y nirA del factor sigma σ54 de la ARN polimerasa para su transcripción, ya que una mutante en los genes responsables (rpoN1/2) también mostró un déficit en crecimiento, actividades NO3- y NO2- reductasas y expresión génica. En conjunto, estos resultados conforman una detallada caracterización, a nivel fisiológico, bioquímico y de regulación génica, de un sistema coordinado de asimilación de NO3- y NO2- y destoxificación de NO en B. diazoefficiens, ambos procesos escasamente estudiados en rizobios, siendo la primera vez que este sistema se ha descrito en bacterias.