Implicación del plásmido psymb para la tolerancia de sinorhizobium meliloti a estrés abiótico

Resumen

IMPORTANCIA DEL PLÁSMIDO pSymB DE S. meliloti PARA LA TOLERANCIA A ESTRÉS ABIÓTICO. Resultados previos nos permitieron elaborar la hipótesis de que los bacteroides de Rhizobium, en el interior de las células de nódulos de leguminosas, necesitan para su normal funcionamiento genes que son necesarios para la osmoadaptación de la bacteria en vida libre. El objetivo de esta memoría de Tesis Doctoral es el de determinar si existe una correlación entre la capacidad de adaptación de la bacteria a estrés osmótico en condiciones de vida libre y su capacidad para establecer simbiosis fijadoras de nitrógeno con plantas leguminosas. Se procederá a la identificación y caracterización de nuevos genes bacterianos implicados en la adaptación a dicho estrés y de su implicación en la simbiosis. Durante el desarrollo de este trabajo han sido realizados experimentos de genómica funcional con el objetivo de identificar genes bacterianos cuya expresión es regulada por la presencia de un estrés hiperosmótico. Utilizando técnicas como microarrays del genoma de S. meliloti 1021 y RT-PCR se determinó como cambia la expresión de cada uno de los genes identificados en el genoma de esta bacteria a distintos tiempos (15, 30, 60 y 240 minutos) tras un choque osmótico inducido por dos diferentes concentraciones de NaCl y Sacarosa (Domínguez-Ferreras et al., 2006). Como resultado de este estudio transcriptómico se han identificado un total de 280 genes cuya expresión disminuye o aumenta de forma muy significativa (<1/4 o >4 veces respecto al control) en todas y en cada una de las condiciones analizadas. De todos los genes localizados en el plásmido simbiótico pSymB que muestran cambio en la expresión el 95% son genes inducidos, indicando así la importancia que tiene este plásmido en la osmoadaptación de S. meliloti. Con objeto de conocer en detalle la implicación del pSymB y de cada uno de los genes osmorregulados de este plásmido en la osmoadaptación, se propuso un estudio que consinstió en determinar las regiones del plásmido pSymB de S. meliloti implicadas en tolerancia a estrés osmótico, verificar la inducibilidad por choque osmótico de los genes osmorregulados del pSymB, caracterizar nuevos genes necesarios para la osmoadaptación de S. meliloti en vida libre y estudiar la importancia de genes implicados en osmoadaptación para el establecimiento de la simbiosis con Medicago truncatula.El plásmido denominado pSymB (1.700 Kb) de S. meliloti es esencial para esta bacteria, por lo que no puede ser eliminado en su totalidad. No obstante, ha sido posible obtener cepas que portan deleciones del mismo (Charles y Finan, 1991). Se ha hecho uso de una colección de cepas derivadas de S. meliloti 1021, cada una de las cuales tiene delecionada (entre 50-200 Kb) una región diferente del pSymB. Se ha realizado un estudio de la capacidad de crecimiento de cada una de estas cepas en medios con alta osmolaridad (NaCl o sacarosa), para determinar qué regiones del pSymB son de importancia para la osmoadaptación de S. meliloti en vida libre. Las cepas RmF909 y RmF514 presentan una disminución en su capacidad de crecimiento desde el inicio de cultivo en 400 y 500mM de NaCl en medio TY. Estos resultados sugerieron que en al menos una región del plásmido simbiótico B (pRmeSU47b) de S. meliloti 1021 se encuentran genes de importancia para la osmoadaptación de la bacteria en vida libre. Se ha escogió un grupo de 13 genes para verificar los datos de la técnica de microarrays y comprobar si estos genes muestran cambios de expresión después de un choque osmótico. Se determinó los cambios en la expresión por RT-PCR a tiempo real de los genes , SMb20249, SMb20345, SMb20346, SMb21406, SMb20651, SMb20094, SMb20346 y SMb21407, de los cuales los seis primeros genes sí mostraron cambios en la expresión por estrés salino. Estos resultados verifican los datos obtenidos con la técnica de microarrays, y sugieren la importancia que dichos genes pueden tener en la osmoadaptación de S. meliloti en vida libre. Sin embargo no se ha podido detectar expresión para los genes SMb20094, SMb20346 y SMb21407. No obstante aunque algunos de los resultados no coincidan con los de microarrays, estos datos obtenidos indican que los resultados de microrrays siempre han de tomarse como preliminares hasta que sean verificados con técnicas mas precisas, como por ejemplo RT-PCR cuantitativa a tiempo real. A través del mutante RmF514 derivado de S. meliloti 1021, se llegó a identificar una región de aproximadamente 200 Kpb del plásmido pSymB. Esta región posee un gen o un conjunto de genes importantes en la tolerancia a NaCl de esta bacteria. A continuación, se partío de un banco de cósmidos de S. meliloti GR4 para la caracterización de dicha región y complementación del fenotipo en NaCl de RmF514. Se identificaron un conjunto de cósmidos que portaban regiones de S. meliloti solapantes e idénticas entre sí. Estas regiones del genoma restauraban el fenotipo en sal de la cepa mutante RmF514. A partir de estos resultados, se identificaron dos genes; el gen SMb21091 (posible lisozima muramidasa) y el gen SM21092 (posible acetiltransferasa) que se caracterizaron de forma detallada para determinar la importancia de cada uno de ellos en la osmoadaptación de la bacteria. Para ello se recurrió a la construcción de mutantes individuales sobre S. meliloti 1021 y se estudió el crecimiento de los mismos, tanto en medio de cultivo sólido como medio líquido y en distintas concentraciones de NaCl. Además de estos experimentos también se estudió la expresión en 400 mM de NaCl mediante actividad ß-glucuronidasa, se determinó la localización subcelular del producto de estos genes mediante fusiones traduccionales a fosfatasa alcalina (PhoA) de E. coli. Los resultados obtenidos con los experimentos realizados mostraron la importancia el gen SMb21091 en la tolerancia a NaCl, pH no óptimo y temperatura no óptima de S. meliloti 1021. Sin embargo, no revelaron lo mismo los resultados que se obtuvieron para el gen SMb21092. Por su implicación en tolerancia a estreses de tipo abiótico, decidimos denominar al gen SMb21091 como satM. Hasta la fecha se desconoce la funcionalidad que podría tener este gen y también la implicación en el establecimiento de la simbiosis con Medicago truncatula. Sin embargo se piensa que la proteína codificada estaría localizada en la envoltura celular y además de su posible papel estructural podría estar implicada en la señalización de alguna cascada de regulación durante el proceso de adaptación de la bacteria a condiciones adversas.