New insights into the mechanism of prebiotics and microbiota on the intestinal defense

Résumé

La Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) integra un grupo de trastornos caracterizados por una inflamación crónica, idiopática, destructiva y recurrente del tracto gastrointestinal, en la que se alternan periodos de remisión. Incluye las dos formas más comunes, la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), así como la colitis colagenosa, la colitis linfocítica y la colitis microscópica atípica. En la actualidad existe un consenso general entre investigadores básicos de la EII de que, tanto la EC como la UC, son el resultado de los efectos combinados de cuatro componentes básicos: cambios globales en el medio ambiente, múltiples variaciones genéticas, alteraciones en la microbiota intestinal, y aberraciones de la respuesta inmune innata y adaptativa.[1] La presente Tesis Doctoral toca varios aspectos de las relaciones existentes entre la microbiota y la biología de la mucosa. Estas relaciones tienen gran importancia para la homeostasis de la mucosa, especialmente en relación con la EII. Es ampliamente reconocido que la microbiota intestinal modula la respuesta inmune, así como la respuesta inmune moldea la microbiota intestinal.[2] Debido a que la EII ha sido fuertemente asociada a la disbiosis y a una respuesta aberrante a la microbiota, en pacientes susceptibles, la modulación del contenido bacteriano luminal se considera un objetivo relevante y potencialmente potente para la intervención terapéutica. En este sentido, los prebióticos y probióticos ofrecen prometedores efectos beneficiosos carentes de efectos secundarios indeseables. Hemos abordado 3 aspectos importantes y relacionados con el tema actual: I. Determinación de efectos no prebióticos de oligosacáridos no digestibles. En primer lugar, hemos caracterizado los efectos directos, no prebióticos, de diversos oligosacáridos no digestibles (NDOS) en macrófagos y linfocitos. Previamente hemos establecido que estos compuestos ejercen acciones importantes en células intestinales epiteliales (IEC).[3] En la linea celular IEC18 se obtuvo un aumento en la producción de GRO-¿, MCP-1 y MIP-2, así como un aumento de IL-8 en las lineas celulares Caco-2 y HT29, a través de un mecanismo que parece implicar la unión al receptor Toll-like 4 (TLR4) y la posterior activación de la vía clásica de NFkB. Dado que los monocitos y, en menor medida, los linfocitos T, también expresan TLR4, era lógico esperar una respuesta coherente con la activación de TLR4. Los prebióticos utilizados fueron la inulina, los fructooligosacáridos (FOS), los galactooligosacáridos (GOS) y los oligosacáridos de leche de cabra (OSLC) a una concentración de 5 g/l. Los datos obtenidos en esplenocitos de ratón, y en monocitos y linfocitos T de rata, indicaron que estas células responden a los NDOS de manera similar a las IEC. Como era de esperar, la respuesta a lipopolisacárido bacteriano (LPS) disminuyó en gran medida en esplenocitos de ratones knock-out para TLR4 (TLR4-/- o TLR4 KO) en comparación con los controles, y éste es el caso también para el efecto de los NDOS sobre la producción de TNF-¿ , IL-6, IL-17 e IFN-gamma, ya sea con o sin LPS. Ésto sugiere que la activación de TLR4 está involucrada en todos estos efectos. Sin embargo, ya que no tenemos evidencia de que se produzca una unión directa al receptor, es posible también que estos compuestos modulen la actividad de TLR4 indirectamente. En cualquier caso, tanto los NDOS como el LPS provocan una respuesta pequeña, pero significativa, en esplenocitos de ratones TLR4 KO, lo que refleja probablemente la capacidad de activar a otros receptores. Debido a que TNF-¿ es producido principalmente por monocitos, mientras que IFN-gamma e IL-17 son producidos por células T, e IL-10 e IL-6 son liberados por ambos tipos de células, los resultados obtenidos en términos generales indican que se produce una activación de monocitos y una inhibición de linfocitos por los NDOS. Por ello probamos el efecto de FOS e inulina sobre monocitos primarios aislados de bazo de rata. Los resultados obtenidos confirman que FOS e inulina promueven la secreción de citoquinas, incluyendo IL-10, GRO-¿ y TNF-¿. Utilizando inhibidores de diversas vías de transducción de señal comprobamos que la vía de NFkB está principalmente involucrada, aunque p38 MAPK y PI3K también desempeñan un papel. Esto es consistente con la activación de TLR4 como mecanismo de acción de NDOS. Los monocitos también fueron aislados de sangre de voluntarios humanos sanos con objeto de confirmar los resultados obtenidos en las células animales. En efecto, tanto FOS como inulina evocaron la secreción de citoquinas (IL-1ß, TNF-¿ e IL-10). Por el contrario, FOS e inulina tuvieron efectos insignificantes en linfocitos de rata, en lugar de la inhibición sugerida por los datos de esplenocitos. Se ha demostrado que los prebióticos transfieren a través de monocapas epiteliales, lo que sugiere que las células situadas en el medio subepitelial pueden ser modulada por estos compuestos.[4] Por lo tanto, mientras que es muy probable que los monocitos de la mucosa estén expuestos a los prebióticos ingeridos, y de ese modo modulados por ellos, no se sabe en qué medida. En cualquier caso, ni la microbiota intestinal, transportando altas cantidades de LPS y otros productos bacterianos, ni los prebióticos, son inflamatorios in vivo. II. Validar el posible uso de los probióticos en el tratamiento de la EII. En segundo lugar, ya que muchos de los efectos beneficiosos de los alimentos funcionales, descritos en modelos animales, no llegan a ser reproducidos en los seres humanos, se propuso el uso de un modelo de colitis verdaderamente crónico, el modelo de colitis por transferencia linfocitaria de células T CD4+ CD62L,[5, 6] para estudiar el posible efecto antiinflamatorio intestinal de FOS, uno de los prebióticos más utilzados en la clínica. De acuerdo con la colitis crónica, los ratones control colíticos continuaron perdiendo peso después del inicio del período de tratamiento, una tendencia que fue contrarrestada rápidamente por el tratamiento con FOS. Puesto que no hubo diferencias significativas en la ingesta de alimentos, estos efectos están probablemente relacionados con la caquexia derivada de la inflamación en los ratones control colíticos, mostrando FOS un efecto protector. Este beneficio inicial se confirmó por una actividad colónica mieloperoxidasa (MPO) y fosfatasa alcalina (AP) significativamente inferior, por una disminución de los niveles de expresión génica de S100A8, y por una disminución en la liberación de citoquinas pro-inflamatorias por células mesentéricas de nódulos linfáticos (MLNC) cultivadas ex vivo (IFN-gamma, IL-17 y TNF-¿). Además, los ratones tratados con FOS tuvieron una puntuación de daño macroscópico menor (debido a un impacto favorable en las adherencias y fibrosis), aunque no fue significativo. Se cree que FOS amortigua la inflamación intestinal por modulación de la microbiota entérica. Por ello estudiamos los cambios en la microbiota fecal para confirmar que FOS se comporta como prebiótico en nuestras condiciones experimentales. Encontramos un aumento significativo en las bacterias ácido lácticas en los ratones tratados con FOS. Es posible que la contribución de la disbiosis se reduzca en este modelo. Por otra parte, hemos establecido que FOS tiene acciones inmunomoduladoras directas en IEC y en monocitos en ausencia de bacterias (resultados no publicados y [3]). III. Verificar la importancia de la microbiota para desarrollar EII. En tercer lugar, varios estudios indican que la colitis puede ser inducida utilizando DSS en ausencia de microbiota, siendo contradictorio con el papel atribuido a las bacterias luminales en la inducción de la colitis y la EII en los seres humanos. Por lo tanto, este aspecto se evaluó induciendo colitis por DSS en ratones convencionales, en ratones libres de gérmenes (germ-free, GF), así como en un modelo de reducción drástica de microbiota inducido por antibióticos (condiciones "pseudo GF¿ -PGF-). Nuestros resultados en el experimento principal (GF vs. ratones convencionales) muestran que los ratones convencionales responden como cabría esperar al DSS, es decir, con pérdida de peso corporal, incremento de actividad MPO y AP, aumentando los niveles de expresión génica en colon (IL-10, IFN-gamma, IL-1beta, S100A8, REG3-gamma), además de mostrando una mayor liberación de citoquinas por MLNC (IFN-gamma) y por esplenocitos (IL-6, IL-17 and IFN-gamma) cultivados ex vivo. Los resultados obtenidos en ratones GF fueron dramáticamente diferentes. Aunque la pérdida de peso corporal fue comparable a la de los ratones convencionales, el colon mostró pocos signos inflamatorios. La puntuación del daño macroscópico también aumentó en menor medida que en los animales convencionales, no mostrando signos de hiperemia, engrosamiento o deformación colónica. Sin embargo, los ratones GF tratados con DSS se veían más enfermos que los ratones normales en nuestro experimento, y hubo señales de pérdida de sangre masiva, en consonancia con observaciones anteriores,[7] lo que sugiere que, si bien la colitis se atenuó en condiciones GF, la pérdida de sangre fue mayor. Por lo tanto, nuestros datos indican inequívocamente que la inflamación colónica inducida por DSS y la respuesta inmune están disminuidas en gran medida en ratones GF, aunque la interrupción epitelial se ve aumentada. Para caracterizar mejor la interacción entre DSS y microbiota utilizamos el modelo PGF. Este enfoque nos ha permitido poner a prueba si la ausencia adquirida de microorganismos luminales, mediante el empleo de un coctel de antibióticos, tendría efectos similares a los observados en ratones GF innatos. En efecto, los resultados obtenidos relativos a la inflamación intestinal fueron en gran medida comparables a los del experimento principal. A nivel histológico, los ratones control tratados con DSS mostraron infiltración, edema submucoso, distorsión de las criptas y erosiones epiteliales, mientras que los ratones PGF tratados con DSS mostraron una arquitectura de la mucosa prácticamente intacta, con infiltración débil y edema submucoso leve. Esto está en consonancia con los hallazgos de Kitajima y col., que describieron una histología normal de la mucosa en los ratones GF tratados con DSS, a pesar de la marcada pérdida de sangre y muerte temprana.[7] Una diferencia importante entre ratones GF y ratones PGF es que estos últimos no sólo habían disminuido considerablemente la inflamación del colon, sino que también carecían de signos de la enfermedad, es decir, no presentaron pérdida de peso y parecían saludables, en contraste con la respuesta de los ratones GF. Los ratones PGF deben ser capaces de mantener la función de barrera de la mucosa de manera más eficiente que los ratones GF y, de hecho, incluso más que los ratones convencionales. Con el fin de explorar esta posibilidad se midió un conjunto de marcadores de la función de barrera. Cualquiera que sea el mecanismo, nuestros datos indican que (1) en ausencia o presencia limitada de bacterias luminales hay poca respuesta inflamatoria a DSS; (2) los ratones GF parecen sufrir una mayor pérdida de sangre a pesar de la reducida intensidad de la colitis; y (3) la respuesta epitelial a DSS en ratones con flora adquirida (PGF), en lugar de deficiencia congénita (GF), es consistente con la función de barrera mejorada. Como resultado de los estudios realizados en la presente Tesis Doctoral se ha llegado a las siguientes conclusiones: I. Los monocitos son activados por FOS y por inulina, y posiblemente también por GOS y OSLC, a través de su unión a TLR4 y la posterior activación de la via de NFkB y otras vías, como la p38 MAPK y PI3K, dando lugar a una mayor secreción de citoquinas. Se trata de una acción directa de estos compuestos, la cual puede estar involucrada en sus efectos in vivo. II. FOS es eficaz en la colitis inducida por transferencia linfocitaria a la dosis de 75 mg/día al ser administrado como postratamiento. Es un avance significativo en la evidencia preclínica que apoya el uso de este prebiótico en la EII. El efecto antiinflamatorio observado utilizando esta dosis de FOS sugiere que las dosis usadas en ensayos clínicos podrían ser insuficientes. III. La colitis inducida por DSS es atenuada en gran medida debido a la ausencia de microorganismos luminales, ya sea de manera innata o adquirida. Sin embargo, el estado general de los animales criados en condiciones GF se vió deteriorado en gran medida, probablemente debido a la pérdida masiva de sangre y a un fallo de la función de barrera epitelial. IV. Se produce un refuerzo de la función de barrera epitelial en respuesta a DSS, el cual depende fundamentalmente de la exposición previa a la microbiota. Una exposición previa aumenta el número de células Treg, con la consiguiente producción de IL-10 y una disminución en el compromiso de la mucosa epitelial. Este refuerzo es sobrepasado por la respuesta inflamatoria normal en animales convencionales. [1] Schirbel A, Fiocchi C. Inflammatory bowel disease: Established and evolving considerations on its etiopathogenesis and therapy. J Dig Dis 2010;11:266-76. [2] de Medina FS, Ortega-Gonzalez M, Gonzalez-Perez R, Capitán-Cañadas F, Martinez-Augustin O. Host-microbe interactions: the difficult yet peaceful coexistence of the microbiota and the intestinal mucosa. Br J Nutr 2013;109 Suppl 2:S12-20. [3] Ortega-González M, Ocón B, Romero-Calvo I, Anzola A, Guadix E, Zarzuelo A, et al. Non-digestible oligosaccharides exert non-prebiotic effects on intestinal epithelial cells enhancing the immune response via activation of TLR4-NF¿B. Mol Nutr Food Res 2013. [4] Eiwegger T, Stahl B, Haidl P, Schmitt J, Boehm G, Dehlink E, et al. Prebiotic oligosaccharides: in vitro evidence for gastrointestinal epithelial transfer and immunomodulatory properties. Pediatr Allergy Immunol 2010;21:1179-88. [5] Ostanin DV, Bao J, Koboziev I, Gray L, Robinson-Jackson SA, Kosloski-Davidson M, et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2009;296:G135-46. [6] Koboziev I, Karlsson F, Zhang S, Grisham MB. Pharmacological intervention studies using mouse models of the inflammatory bowel diseases: translating preclinical data into new drug therapies. 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